وایلد تاک DNA پلیمراز
Taq DNA Polymerase یک DNA پلیمراز مقاوم در برابر حرارت از Thermus aquaticus YT-1 است که دارای فعالیت پلیمراز 5'→3' و فعالیت اندونوکلئاز فلپ 5' است.
اجزاء
| جزء | HC1010A-01 | HC1010A-02 | HC1010A-03 | HC1010A-04 |
| 10× Taq Buffer | 2×1 میلی لیتر | 2×10 میلی لیتر | 2×50 میلی لیتر | 5×200 میلی لیتر |
| Taq DNA Polymerase (5 U/μL) | 0.1 میلی لیتر | 1 میلی لیتر | 5 میلی لیتر | 5×10 میلی لیتر |
شرایط نگهداری
حمل و نقل در دمای 0 درجه سانتیگراد و در دمای 25- تا 15 درجه سانتیگراد نگهداری شود.
تعریف واحد
یک واحد به عنوان مقدار آنزیمی است که 15 نانومول dNTP را در مواد نامحلول در اسید در 30 دقیقه در دمای 75 درجه سانتیگراد ترکیب می کند.
کنترل کیفیت
1.سنجش خلوص پروتئین (SDS-PAGE):خلوص Taq DNA پلیمراز ≥95٪ با تجزیه و تحلیل SDS-PAGE تعیین شد.
2.Endفعالیت onuclease:حداقل 5 U از Taq DNA پلیمراز با 1 میکروگرم λDNA به مدت 16 ساعت در دمای 37 ℃ منجر به تخریب قابل تشخیص نمی شود.
3.فعالیت اگزونوکلئاز:حداقل 5 U از Taq DNA پلیمراز با 1 میکروگرم λ -Hind Ⅲ DNA هضم به مدت 16 ساعت در دمای 37 ℃ منجر به هیچ تخریب قابل تشخیصی به عنوان تعیین شده است.
4.فعالیت Nickase:حداقل 5 واحد از Taq DNA پلیمراز با 1 میکروگرم DNA pBR322 به مدت 16 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد منجر به تخریب قابل تشخیص نمی شود.
5.فعالیت RNase:حداقل 5 واحد از Taq DNA پلیمراز با 1.6 میکروگرم MS2 RNA به مدت 16 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد منجر به تخریب قابل تشخیص نمی شود.
6.E. coliDNA:5 U از Taq DNA پلیمراز برای حضور DNA ژنومی E. coli با استفاده از TaqMan qPCR با پرایمرهای اختصاصی برای مکان E. coli 16S rRNA غربالگری می شود.آلودگی DNA ژنومی E. coli ≤1 کپی است.
7.تقویت PCR (5.0 کیلوبایت لامبدا DNA)- یک واکنش 50 میکرولیتری حاوی 5 نانوگرم DNA لامبدا با 5 واحد Taq DNA پلیمراز برای 25 سیکل تقویت PCR منجر به محصول 5.0 کیلوبایتی مورد انتظار می شود.
تنظیم واکنش
| اجزاء | جلد |
| DNA الگوa | اختیاری |
| پرایمر جلو 10 میکرومولار | 1 میکرولیتر |
| پرایمر معکوس 10 میکرومولار | 1 میکرولیتر |
| مخلوط dNTP (هر کدام 10 میلی‌مولار) | 1 میکرولیتر |
| 10×Taq Buffer | 5 میکرولیتر |
| Taq DNA پلیمرازب | 0.25 میکرولیتر |
| آب بدون هسته | تا 50 میکرولیتر |
یادداشت:
1) غلظت واکنش بهینه الگوهای مختلف متفاوت است.جدول زیر استفاده از الگوی توصیه شده سیستم واکنش 50 میکرولیتری را نشان می دهد.
| DNA | میزان |
| ژنومیک | 1 نانوگرم-1 میکروگرم |
| پلاسمید یا ویروسی | 1 pg-1 ng |
2) غلظت بهینه Taq DNA Polymerase ممکن است از 0.25 µL~1 µL در کاربردهای تخصصی متغیر باشد.
واکنشبرنامه
| گام | درجه حرارت(درجه سانتی گراد) | زمان | چرخه ها |
| دناتوراسیون اولیهa | 95 ℃ | 5 دقیقه | - |
| دناتوره سازی | 95 ℃ | 15-30 ثانیه | 30-35 چرخه |
| آنیل کردنب | 60 ℃ | 15 ثانیه | |
| افزونه | 72 ℃ | 1 کیلوبایت در دقیقه | |
| پسوند نهایی | 72 ℃ | 5 دقیقه | - |
یادداشت:
1) شرایط دناتوراسیون اولیه برای اکثر واکنش های تقویت مناسب است و می تواند با توجه به پیچیدگی ساختار قالب تغییر یابد.اگر ساختار قالب پیچیده باشد، زمان پیش از دناتوره شدن را می توان به 5 تا 10 دقیقه افزایش داد تا اثر دناتوراسیون اولیه بهبود یابد.
2) دمای بازپخت باید با توجه به مقدار Tm پرایمر تنظیم شود که معمولاً 3 ~ 5 ℃ کمتر از مقدار Tm پرایمر تنظیم می شود.برای الگوهای پیچیده، تنظیم دمای بازپخت و افزایش زمان گسترش برای دستیابی به تقویت کارآمد ضروری است.
