پروتئیناز K mNGS (مایع)
پروتئیناز K یک پروتئاز سرین پایدار با ویژگی سوبسترای وسیع است.بسیاری از پروتئین ها را در حالت طبیعی حتی در حضور مواد شوینده تجزیه می کند.شواهد حاصل از مطالعات ساختار کریستالی و مولکولی نشان می دهد که آنزیم متعلق به خانواده سوبتیلیسین با یک سه گانه کاتالیزوری مکان فعال است (Asp39-خود69-سر224).محل غالب برش، پیوند پپتیدی مجاور گروه کربوکسیل اسیدهای آمینه آلیفاتیک و آروماتیک با گروه های آلفا آمینه مسدود شده است.معمولاً به دلیل ویژگی گسترده آن استفاده می شود.این پروتئیناز K به طور خاص برای mNGS طراحی شده است.در مقایسه با سایر پروتئیناز K، حاوی آلودگی کمتری با اسید نوکلئیک با عملکرد آنزیمی یکسان است که می تواند کاربرد mNGS پایین دستی را بهتر تضمین کند.
شرایط نگهداری
2-8 درجه سانتیگراد به مدت 2 سال
مشخصات
| ظاهر | مایع بی رنگ تا قهوه ای روشن |
| فعالیت | ≥800 U/ml |
| غلظت پروتئین | ≥20 میلی گرم در میلی لیتر |
| نیکاز | هیچ کدام شناسایی نشد |
| DNase | هیچ کدام شناسایی نشد |
| RNase | هیچ کدام شناسایی نشد |
خواص
| شماره EC | 3.4.21.64(نوترکیب از آلبوم Tritirachium) |
| نقطه ایزوالکتریک | 7.81 |
| pH بهینه | 7.0- 12.0 شکل 1 |
| دمای بهینه | 65 ℃ شکل 2 |
| ثبات pH | pH 4.5- 12.5 (25 ℃، 16 ساعت) شکل 3 |
| پایداری حرارتی | زیر 50 ℃ (pH 8.0، 30 دقیقه) شکل 4 |
| پایداری ذخیره سازی | بیش از 90٪ فعالیت برای 12 ماه در 25 ℃ |
| فعال کننده ها | SDS، اوره |
| بازدارنده ها | دی ایزوپروپیل فلوروفسفات؛فنیل متیل سولفونیل فلوراید |
برنامه های کاربردی
1. کیت تشخیص ژنتیکی
2. کیت های استخراج RNA و DNA
3. استخراج اجزای غیر پروتئینی از بافت ها، تجزیه ناخالصی های پروتئینی مانند DNAواکسن و تهیه هپارین
4. تهیه DNA کروموزوم با الکتروفورز پالسی
5. وسترن بلات
6. معرف های آلبومین گلیکوزیله آنزیمی تشخیص در شرایط آزمایشگاهی
موارد احتیاط
هنگام استفاده یا وزن کردن از دستکش و عینک محافظ استفاده کنید و پس از استفاده به خوبی تهویه کنید.این محصول ممکن است باعث واکنش آلرژیک پوستی و تحریک جدی چشم شود.در صورت استنشاق، ممکن است باعث آلرژی یا علائم آسم یا تنگی نفس شود.ممکن است باعث تحریک تنفسی شود.
تعریف واحد
یک واحد (U) به عنوان مقدار آنزیم مورد نیاز برای هیدرولیز کازئین برای تولید 1 میکرومول تعریف می شود.تیروزین در دقیقه تحت شرایط زیر.
آماده سازی معرف ها
معرف I: 1 گرم کازئین شیر در 50 میلی لیتر محلول فسفات سدیم 0.1 مولار (pH 8.0) حل شد، در آب 70-65 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه انکوبه شد، مخلوط شد و حل شد، با آب سرد شد، با هیدروکسید سدیم به pH 8.0 تنظیم شد و حجم ثابت شد. 100 میلی لیتر.
معرف II: 0.1M تری کلرواستیک اسید، 0.2M استات سدیم، 0.3M اسید استیک.
معرف III: 0.4M Na2CO3راه حل.
معرف IV: معرف فورینت 5 بار با آب خالص رقیق شده است.
معرف V: رقیق کننده آنزیم: محلول سدیم فسفات 0.1 مولار (pH 8.0).
معرف VI: محلول تیروزین: 0، 0.005، 0.025، 0.05، 0.075، 0.1، 0.25 umol/ml تیروزین محلول با 0.2M HCl.
روش
1. 0.5 میلی لیتر از معرف I از قبل تا دمای 37 درجه سانتیگراد گرم شده است، 0.5 میلی لیتر محلول آنزیم اضافه کنید، خوب مخلوط کنید و در انکوبه کنید.37 درجه به مدت 10 دقیقه
2. 1 میلی لیتر از معرف II را برای توقف واکنش اضافه کنید، خوب مخلوط کنید و انکوباسیون را برای 30 دقیقه ادامه دهید.
3. محلول واکنش را سانتریفیوژ کنید.
4. 0.5 میلی لیتر مایع رویی بردارید، 2.5 میلی لیتر معرف III، 0.5 میلی لیتر معرف IV اضافه کنید، خوب مخلوط کنید و در دمای 37 درجه انکوبه کنید.به مدت 30 دقیقه
5. OD660به عنوان OD تعیین شد1;گروه شاهد: 0.5 میلی لیتر از معرف V برای جایگزینی آنزیم استفاده می شودراه حل برای تعیین OD660به عنوان OD2، ΔOD=OD1-OD2.
6. منحنی استاندارد L-تیروزین: 0.5 میلی لیتر محلول L-تیروزین با غلظت های مختلف، 2.5 میلی لیتر معرف III، 0.5 میلی لیتر معرف IV در لوله سانتریفیوژ 5 میلی لیتر، انکوبه در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه، تشخیص OD660برای غلظت های مختلف L-تیروزین، سپس منحنی استاندارد Y=kX+b به دست آمد، که در آن Y غلظت L-تیروزین است، X OD است.600.
محاسبه
2: حجم کل محلول واکنش (میلی لیتر)
0.5: حجم محلول آنزیمی (میلی لیتر)
0.5: حجم مایع واکنش مورد استفاده در تعیین کروموژنیک (mL)
10: زمان واکنش (دقیقه)
Df: رقیق سازی چندگانه
C: غلظت آنزیم (mg/mL)
منابع
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972)؛23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.بیوفیز.Res.اشتراک.(1971)؛44:513.
3. هیلز، اچ.و همکاران،یوروجی بیوشیم.(1975)؛56:103-108.
4. سامبروک جیet آل.، شبیه سازی مولکولی: کتابچه راهنمای آزمایشگاهی، ویرایش دوم، کلد اسپرینگ هاربرLaboratory Press، Cold Spring Harbor (1989).
ارقام
شکل.1 حالت مطلوب pH
محلول بافر 100 میلی مولار: pH6.0-8.0، فسفات سدیم.pH8.0-9.0، Tris-HCl.pH 9.0-12.5، گلایسین-NaOH. غلظت آنزیم: 1 میلی گرم در میلی لیتر
شکل 2 دمای بهینه
واکنش در بافر 20 میلی مولار K-phosphate pH 8.0.غلظت آنزیم: 1 میلی گرم در میلی لیتر
شکل 3 pH ثبات
25 ℃، 16 ساعت درمان با محلول بافر 50 میلی مولار: pH 4.5-5.5، استات.pH 6.0-8.0، فسفات سدیم.pH 8.0-9.0، Tris-HCl.pH 9.0-12.5، گلایسین-NaOH.غلظت آنزیم: 1 میلی گرم در میلی لیتر
شکل 4 حرارتی ثبات
30 دقیقه با بافر 50 میلی مولار Tris-HCl، pH 8.0.غلظت آنزیم: 1 میلی گرم در میلی لیتر
شکل 5 ذخیره سازی پایدارty at 25 درجه سانتیگراد
