5×Neoscript Fast RT-qPCR Premix plus-UNG
شماره گربه: HCB5142A
Neoscript Fast RT Premix-UNG (Probe qRT-PCR) یک مخلوط مبتنی بر پروب تک لوله ای بسیار پایدار است که برای رونویسی معکوس یک مرحله ای و PCR کمی (qRT-PCR) مناسب است.از پیش اختلاط پرایمرها و پروب ها پشتیبانی می کند و پس از نگهداری طولانی مدت در دمای پایین پایدار می ماند.نمونه مورد آزمایش را می توان به طور مستقیم هنگام استفاده، بدون عملیات لوله باز کردن/پیپت کردن اضافی اضافه کرد.این محصول اجزایی مانند DNA پلیمراز شروع داغ، M-MLV، اوراسیل DNA گلیکوزیلاز حساس به حرارت (TS-UNG)، مهارکننده RNase، MgCl را فراهم می کند.2، dNTP ها (با dUTP به جای dTTP) و تثبیت کننده ها.با تکثیر سریع ترانس کریپتاز معکوس اصلاح شده ژنتیکی و DNA پلیمراز، می توان تکثیر PCR را در عرض 20 تا 40 دقیقه تکمیل کرد.این معرف از بافر مخصوص qPCR با آنزیم های مخلوط آنزیم تقویت ضد مهاری و آنزیم UNG استفاده می کند.بنابراین، می تواند تقویت خوبی از ژن های هدف را به دست آورد و از تقویت کاذب ناشی از آلودگی باقیمانده PCR و آئروسل جلوگیری کند.این معرف با اکثر ابزارهای PCR کمی فلورسانس از سازندگانی مانند Applied Biosystems، Eppendorf، Bio-Rad و Roche سازگار است.
جزء
1.25×Neoscript Fast RTase/UNG Mix
2.5×Neoscript Fast RT Premix Buffer (dUTP)
شرایط نگهداری
تمام اجزاء باید برای نگهداری طولانی مدت در دمای -20 درجه سانتیگراد و حداکثر تا 3 ماه در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شوند.لطفاً پس از ذوب شدن کاملاً مخلوط کنید و قبل از استفاده سانتریفیوژ کنید.از انجماد و ذوب مکرر خودداری کنید.
آماده سازی سیستم واکنش qRT-PCR
| اجزاء | 25μLسیستم | 50μLسیستم | غلظت نهایی |
| 5×Neoscript Fast RT Premix Buffer (dUTP) | 5 میکرولیتر | 10 میکرولیتر | 1× |
| 25×Neoscript Fast RTase/UNG Mix | 1 میکرولیتر | 2 میکرولیتر | 1× |
| 25× مخلوط پرایمر-پرابa | 1 میکرولیتر | 2 میکرولیتر | 1× |
| الگوی RNAb | – | – | – |
| ddH2O | تا 25 میکرولیتر | تا 50 میکرولیتر | – |
1) a. غلظت نهایی پرایمر معمولا 0.2μM است.برای نتایج بهتر، غلظت پرایمر را می توان در محدوده 0.2-1μM بهینه کرد.به طور کلی، غلظت پروب را می توان در محدوده 0.1-0.3μM بهینه کرد.
2) ب. هنگام استفاده از روش سریع PCR، افزایش غلظت پرایمرها و پروب ها ممکن است منجر به نتایج تقویت بهتر شود و نسبت آنها باید بر این اساس بهینه شود.
3) انواع مختلف نمونه ها حاوی انواع مختلف و محتوای بازدارنده و تعداد کپی ژن هدف هستند.حجم نمونه باید با شرایط واقعی در نظر گرفته شود.در صورت لزوم نمونه را با آب بدون نوکلئاز یا بافر TE رقیق کنید.
واکنش جشرایط
| روش PCR منظم | روش سریع PCR | ||||||
| روش | دما | زمان | چرخه | روش | دما | زمان | چرخه |
| رونویسی معکوس | 50 درجه سانتیگراد | 10-20 دقیقه | 1 | رونویسی معکوس | 50 درجه سانتیگراد | 5 دقیقه | 1 |
| پلیمراز فعال سازی | 95 درجه سانتیگراد | 1-5 دقیقه | 1 | پلیمراز فعال سازی | 95 درجه سانتیگراد | دهه 30 | 1 |
| دناتوره سازی | 95 درجه سانتیگراد | 10-20 | 40-50 | دناتوره سازی | 95 درجه سانتیگراد | 1-3 ثانیه | 40-50 |
| آنیل کردن و افزونه | 56-64 ℃ | دهه 20-60 | آنیل کردن و افزونه | 56-64 ℃ | 3-20 | ||
کنترل کیفیت
1.تشخیص عملکرد: حساسیت، ویژگی و تکرارپذیری qPCR.
2.بدون فعالیت نوکلئاز برون زا: بدون آلودگی اگزونوکلئاز و اندونوکلئاز خارجی.
یادداشت
1.نرخ تقویت DNA پلیمراز سریع کمتر از 1kb/10s نیست.ابزارهای مختلف PCR دارای سرعت گرمایش و سرمایش، حالت‌های کنترل دما و هدایت حرارتی متفاوتی هستند و بنابراین بهینه‌سازی غلظت پرایمر/پراب و روش اجرا در ترکیب با دستگاه PCR سریع خاص شما ضروری است.
2.این محصول کاربرد وسیعی دارد و برای تشخیص مولکولی با حساسیت بالا مناسب است.روش PCR سه مرحله ای برای پرایمرهایی با دمای بازپخت پایین یا برای تکثیر قطعات بلند بالای 200 جفت باز توصیه می شود.
3.از آنجایی که آمپلیکون های مختلف بازده استفاده متفاوتی از dUTP و حساسیت متفاوت به UNG دارند، در صورت کاهش حساسیت تشخیص هنگام استفاده از سیستم UNG، معرف ها باید بهینه شوند.لطفا در صورت نیاز برای پشتیبانی فنی با ما تماس بگیرید.
4.برای جلوگیری از تقویت محصولات حامل PCR، منطقه آزمایشی و پیپت اختصاصی برای تقویت مورد نیاز است.با دستکش کار کنید و مرتب تعویض کنید و بعد از تقویت لوله PCR را باز نکنید.
