2×Sensi Direct Premix-UNG (Probe qPCR)
شماره گربه: HCB5151A
SensiDirect Premix-UNG (Probe qPCR) برای انجام PCR به طور مستقیم از نمونه ها بدون استخراج DNA یا آماده سازی نمونه طراحی شده است.این معرف شامل DNA پلیمراز داغ، اوراسیل DNA گلیکوزیلاز (UNG)، مهارکننده RNase، MgCl است.2، dNTP ها (با dUTP به جای dTTP) و تثبیت کننده ها برای PCR کمی (qPCR).این معرف دارای تحمل بالایی در برابر مهارکننده است و بنابراین می توان آن را مستقیماً برای تشخیص نمونه هایی مانند سواب گلو، بزاق، خون کامل ضد انعقاد، پلاسما و سرم بدون استخراج DNA استفاده کرد.این معرف از بافر اختصاصی برای qPCR با آنزیم های ترکیبی DNA پلیمراز ضد مهاری و آنزیم UNG استفاده می کند.بنابراین می‌تواند تکثیر خوبی از ژن‌های هدف در نمونه‌های حاوی بازدارنده به دست آورد و از تقویت مثبت کاذب ناشی از آلودگی باقیمانده و آئروسل PCR جلوگیری کند.این معرف با اکثر ابزارهای PCR کمی فلورسنت مانند Applied Biosystems، Eppendorf، Bio-Rad، Roche و غیره سازگار است.
اجزاء
1. 50× SensiDirect Enzyme/UNG Mix
2. 2×SensiDirect Premix Buffer (dUTP)
شرایط نگهداری
تمام اجزاء باید برای نگهداری طولانی مدت در دمای -20 درجه سانتیگراد و حداکثر تا 3 ماه در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شوند.لطفاً پس از ذوب شدن کاملاً مخلوط کنید و قبل از استفاده سانتریفیوژ کنید.از انجماد و ذوب مکرر خودداری کنید.
پروتکل دوچرخه سواری
| گام | درجه حرارت | زمان | چرخه |
| هضم | 50 درجه سانتیگراد | 2 دقیقه | 1 |
| فعال سازی پلیمراز | 95 درجه سانتیگراد | 1-5 دقیقه | 1 |
| دناتوره | 95 درجه سانتیگراد | 10-20 | 40-50 |
| بازپخت / گسترش | 56-64 ℃ | دهه 20-60 |
دستورالعمل های لوله گذاری
| معرف | حجم در هر واکنش | حجم در هر واکنش | غلظت نهایی |
| 2×SensiDirect Premix Buffer (dUTP) | 12.5 میکرولیتر | 25 میکرولیتر | 1× |
| 50× SensiDirect آنزیم / مخلوط UNG | 0.5 میکرولیتر | 1 میکرولیتر | 1× |
| 25× مخلوط پرایمر-پراب1، 2 | 1 میکرولیتر | 2 میکرولیتر | 1× |
| نمونه3، 4 | - | - | - |
| ddH2O | - | - | - |
| حجم کل | 25 میکرولیتر | 50 میکرولیتر | - |
1. غلظت نهایی پرایمر معمولا 0.2μM است.برای نتایج بهتر، غلظت پرایمر را می توان در محدوده 0.2-1μM بهینه کرد.
2. به طور کلی، غلظت پروب را می توان در محدوده 0.1-0.3μM بهینه کرد.غلظت بهینه پروب به ابزار تقویت زمان واقعی PCR، نوع پروب و نوع ماده برچسب‌دار فلورسنت مربوط می‌شود.لطفاً به دفترچه راهنمای ابزار یا الزامات خاص هر پروب فلورسنت مراجعه کنید.
3. انواع مختلف نمونه ها حاوی انواع مختلف و محتوای بازدارنده و تعداد کپی ژن هدف هستند.حجم نمونه باید با شرایط واقعی در نظر گرفته شود.در صورت لزوم با افزودن آب بدون نوکلئاز یا بافر TE نمونه را رقیق کنید.
4. حجم توصیه شده از نمونه های مختلف:
| نمونه | حجم برای یک 50 μL واکنش | بیشترین نسبت |
| خون کامل ضد انعقاد | 2.5 میکرولیتر | 5% |
| پلاسما | 15 میکرولیتر | 30% |
| سرم | 10 میکرولیتر | 20% |
| سواب گلو | 10 میکرولیتر | 20% |
| بزاق | 10 میکرولیتر | 20% |
کنترل کیفیت
1. تشخیص عملکرد: حساسیت، ویژگی و تکرارپذیری qPCR.
2. عدم فعالیت نوکلئاز برون زا: بدون آلودگی اگزونوکلئاز و اگزونوکلئاز.
یادداشت های محصول
1. این محصول از نوع جدیدی از DNA پلیمراز شروع داغ استفاده می کند که می تواند در 1-5 دقیقه فعال شود. از آنجایی که بافر واکنش آن بهینه شده است، برای PCR کمی فلورسانس دو یا چندگانه با استفاده از روش پروب مناسب تر است.
2. اگر مقدار Rn تقویت PCR خیلی کم باشد یا تقویت آشکارا مهار شود، کاهش مقدار نمونه، افزایش حجم واکنش یا رقت قبلی نمونه ممکن است نتایج را بهبود بخشد.
3. جمع آوری خون، بزاق، ادرار، سواب گلو و غیره باید از الزامات معیارهای بالینی پیروی کند و از نمونه تازه می توان برای جلوگیری از تخریب اسید نوکلئیک استفاده کرد.
4. از آنجایی که آمپلیکون های مختلف کارایی استفاده متفاوتی نسبت به dUTP و حساسیت به UNG دارند، در صورت کاهش حساسیت تشخیص هنگام استفاده از سیستم UNG، معرف ها باید بهینه شوند.لطفا در صورت نیاز برای پشتیبانی فنی با ما تماس بگیرید.
5. برای جلوگیری از تقویت محصولات حامل PCR بین واکنش های یک مرحله ای، منطقه آزمایشی و پیپت اختصاصی برای تقویت مورد نیاز است.با دستکش کار کنید و مرتب تعویض کنید و بعد از تقویت PCR لوله واکنش را باز نکنید.
