Hotstart Taq DNA Polymerase
Hot Start Taq DNA Polymerase (اصلاح آنتی بادی) یک DNA پلیمراز مقاوم در برابر حرارت با شروع گرم از Thermus aquaticus YT-1 است که دارای فعالیت پلیمراز 5'→3' و فعالیت اندونوکلئاز فلپ 5' است.Taq DNA پلیمراز داغ یک Taq DNA پلیمراز است که توسط آنتی بادی های حرارت پذیر Taq اصلاح می شود.اصلاح آنتی بادی باعث افزایش ویژگی، حساسیت و بازده PCR شد.
اجزاء
| جزء | HC1012A-01 | HC1012A-02 | HC1012A-03 | HC1012A-04 |
| بافر 5×HC Taq | 4×1 میلی لیتر | 4×10 میلی لیتر | 4×50 میلی لیتر | 5×400 میلی لیتر |
| Hot Start Taq DNA Polymerase (آنتی بادی اصلاح شده) (5 U/μL) | 0.1 میلی لیتر | 1 میلی لیتر | 5 میلی لیتر | 10×5 میلی لیتر |
برنامه های کاربردی
10 میلی‌مولار Tris-HCl (pH 7.4 در دمای 25 درجه سانتیگراد)، 100 میلی‌مولار KCl، 0.1 میلی‌مولار EDTA، 1 میلی‌مولار دی تیوتریتول، 0.5 درصد Tween20، 0.5 درصد IGEPALCA-630 و 50 درصد گلیسرول.
شرایط نگهداری
حمل و نقل در دمای 0 درجه سانتیگراد و در دمای 25- تا 15 درجه سانتیگراد نگهداری شود.
تعریف واحد
یک واحد به عنوان مقدار آنزیمی است که 15 نانومول dNTP را در مواد نامحلول در اسید در 30 دقیقه در دمای 75 درجه سانتیگراد ترکیب می کند.
کنترل کیفیت
1.Endفعالیت onuclease:جوجه کشی 20 واحد آنزیم با 4 میکروگرم DNA pUC19 به مدت 4 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد منجر به تخریب قابل تشخیص DNA نشد که توسط الکتروفورز ژل تعیین شد.
2.لامبدا PCR 5 کیلوبایت:25 چرخه تکثیر PCR 5 نانوگرم DNA لامبدا با 1.25 واحد Taq DNA پلیمراز در حضور 200 میکرومولار dNTPs و پرایمرهای 0.2 میکرومولار منجر به محصول مورد انتظار 5 کیلوبایت می شود.
3.فعالیت اگزونوکلئاز:انکوباسیون یک واکنش 50 میکرولیتری حاوی حداقل 12.5 U از Taq DNA Polymerase با 10 نانومول الیگونوکلئوتید 5´-FAM به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد هیچ تخریب قابل تشخیصی را به همراه نداشت.
4.فعالیت RNase:جوجه کشی 10 میکرولیتر واکنش حاوی 20 واحد آنزیم با 1 میکروگرم رونوشت RNA به مدت 2 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد منجر به تخریب قابل تشخیص RNA همانطور که توسط الکتروفورز ژل تعیین شد.
5.غیر فعال سازی حرارتی:خیر
سیستم واکنش
| اجزاء | جلد |
| DNA الگوa | اختیاری |
| پرایمر جلو 10 میکرومولار | 0.5 میکرولیتر |
| پرایمر معکوس 10 میکرومولار | 0.5 میکرولیتر |
| مخلوط dNTP (هر کدام 10 میلی‌مولار) | 0.5 میکرولیتر |
| بافر 5×HC Taq | 5 میکرولیتر |
| Taq DNA پلیمرازب(5U/μL) | 0.125 میکرولیتر |
| آب بدون هسته | تا 25 میکرولیتر |
یادداشت:
1) الف.
| DNA | میزان |
| ژنومیک | 1 نانوگرم-1 میکروگرم |
| پلاسمید یا ویروسی | 1 pg-1 ng |
2) ب.غلظت بهینه Taq DNA Polymerase ممکن است از 5-50 واحد در میلی لیتر (0.1-0.5 واحد در 25 میکرولیتر واکنش) در کاربردهای تخصصی متغیر باشد.
پروتکل ترمال سیکلینگ
PCR
| گام | درجه حرارت(درجه سانتی گراد) | زمان | چرخه ها |
| دناتوراسیون اولیهa | 95 ℃ | 1-3 دقیقه | - |
| دناتوره سازی | 95 ℃ | 15-30 ثانیه | 30-35 چرخه |
| آنیل کردنب | 45-68 ℃ | 15-60 ثانیه | |
| افزونه | 68 ℃ | 1 کیلوبایت در دقیقه | |
| پسوند نهایی | 68 ℃ | 5 دقیقه | - |
یادداشت:
1) دناتوراسیون اولیه 1 دقیقه در دمای 95 درجه سانتیگراد برای بیشتر تقویت ها کافی است.برای الگوهای دشوار، دناتوراسیون طولانی‌تر 2-3 دقیقه در دمای 95 درجه سانتیگراد توصیه می‌شود.با کلنی PCR، دناتوراسیون اولیه 5 دقیقه در دمای 95 درجه سانتی گراد توصیه می شود.
2) مرحله بازپخت معمولاً 15-60 ثانیه است.دمای بازپخت بر اساس Tm جفت پرایمر است و معمولاً 45-68 درجه سانتیگراد است.
