مهارکننده Rnase
مهارکننده RNase موشی یک مهارکننده RNase نوترکیب موشی است که از E.coli بیان و خالص شده است.از طریق پیوند غیرکووالانسی به RNase A، B یا C با نسبت 1:1 متصل می شود، در نتیجه فعالیت سه آنزیم را مهار می کند و از RNA در برابر تخریب محافظت می کند.با این حال، در برابر RNase 1، RNase T1، S1 Nuclease، RNase H یا RNase از آسپرژیلوس موثر نیست.مهارکننده RNase موشی توسط RT-PCR، RT-qPCR و mRNA IVT مورد آزمایش قرار گرفت و با انواع مختلف رونوشت‌های معکوس تجاری، DNA پلیمرازها و RNA پلیمرازها سازگار بود.
در مقایسه با مهارکننده‌های RNase انسانی، مهارکننده RNase موشی حاوی دو سیستئین نیست که به اکسیداسیون بسیار حساس هستند که باعث غیرفعال شدن بازدارنده می‌شود.که آن را در غلظت های پایین DTT (کمتر از 1 میلی مولار) پایدار می کند.این ویژگی آن را برای استفاده در واکنش هایی مناسب می کند که غلظت های بالای DTT برای واکنش نامطلوب است (مانند RT-PCR در زمان واقعی).
Aکاربرد
این محصول را می توان به طور گسترده در هر آزمایشی که تداخل RNase برای جلوگیری از تخریب RNA ممکن است استفاده کرد، مانند:
1.سنتز اولین رشته cDNA، RT-PCR، RT-qPCR و غیره.
2.از RNA در برابر تخریب در طول رونویسی/ترجمه آزمایشگاهی محافظت می کند (به عنوان مثال، سیستم تکثیر ویروسی در شرایط آزمایشگاهی).
3.مهار فعالیت RNase در طول جداسازی و خالص سازی RNA.
شرایط نگهداری
این محصول را می توان در دمای -25 تا 15 درجه سانتیگراد با اعتبار 2 سال نگهداری کرد.
بافر ذخیره سازی
50 میلی‌مولار KCl، 20 میلی‌مولار HEPES-KOH (pH 7.6، 25 ℃)، 8 میلی‌مولار DTT و 50 درصد گلیسرول.
تعریف واحد
مقدار بازدارنده RNase موش مورد نیاز برای مهار فعالیت 5 نانوگرم ریبونوکلئاز A به میزان 50 درصد به عنوان یک واحد (U) تعریف شد.
وزن مولکولی پروتئین
وزن مولکولی مهارکننده RNase موش 50 کیلو دالتون است.
کنترل کیفیت
اگزونوکلئاز فعالیت:
40 U از مهارکننده RNase موش با 1 میکروگرم DNA هضم λ -Hind III در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 16 ساعت هیچگونه تخریبی را که توسط الکتروفورز ژل آگارز تعیین شد، ایجاد نمی کند.
فعالیت اندونوکلئاز:
40 U از مهارکننده RNase موش با 1μg λ DNA در دمای 37 درجه به مدت 16 ساعت هیچ گونه تخریبی را که توسط الکتروفورز ژل آگارز تعیین شد، ایجاد نمی کند.
نیک زدن فعالیت:
40U از مهارکننده RNase موشی با 1μg pBR322 در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 16 ساعت هیچ گونه تخریبی را که توسط الکتروفورز ژل آگارز تعیین شد، ایجاد نمی کند.
RNase فعالیت:
40U از مهارکننده RNase موش با 1.6μg MS2 RNA به مدت 4 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد هیچ تخریبی را که توسط الکتروفورز ژل آگارز تعیین شد، ایجاد نمی کند.
E.coli DNA:
40 واحد از مهارکننده RNase موش برای حضور DNA ژنومی E. coli با استفاده از TaqMan qPCR با پرایمرهای اختصاصی برای مکان E. coli 16S rRNA غربالگری می‌شود.آلودگی DNA ژنومی E. coli ≤ 0.1 pg/40 U است.
Nاوتهs
1. نوسان یا هم زدن شدید منجر به غیرفعال شدن آنزیم می شود.
2. محدوده دمایی بهینه این بازدارنده 25-55 ℃ بود و در دمای 65 درجه و بالاتر غیرفعال شد.
3. فعالیت RNase H، RNase 1 و RNase T1 توسط مهار کننده RNase موش مهار نشد.
4. مهار فعالیت RNase در محدوده وسیعی از pH یافت شد (pH 5-9 همه فعال بودند)، و بیشترین فعالیت در pH 7-8 مشاهده شد.
5. از آنجایی که ریبونوکلئازها معمولاً تحت شرایط دناتوره کننده فعالیت خود را حفظ می کنند، باید مراقب بود که از دناتوره شدن مولکول های بازدارنده RNase که با یک ریبونوکلئاز کمپلکس شده اند جلوگیری شود.برای جلوگیری از آزاد شدن ریبونوکلئاز فعال، باید از دمای بیش از 50 درجه سانتیگراد و غلظت بالای اوره یا سایر عوامل دناتوره کننده اجتناب شود.
