اوراسیل DNA گلیکوزیلاز
Uracil-DNA Glycosylase (UNG یا UDG) یک کلون نوترکیب E.coli با وزن مولکولی 25 کیلو دالتون است.آزادسازی اوراسیل آزاد از DNA تک رشته ای و دو رشته ای حاوی اوراسیل را کاتالیز می کند و در برابر RNA غیر فعال است و می تواند برای جلوگیری از آلودگی محصولات تقویت PCR استفاده شود.اصل عمل بر این اساس استوار است که اگر dUTP جایگزین dTTP در واکنش PCR شود و محصول تقویت PCR حاوی بازهای dU تشکیل شود، آنزیم می تواند به طور انتخابی پیوند گلیکوزیدی بازهای U را در تک رشته ای و دو رشته ای بشکند. DNA و تجزیه محصول تقویت PCR.
برنامه پیشنهادی
تقویت پیشگیری از آلودگی
شرایط نگهداری
-20 درجه سانتیگراد برای نگهداری طولانی مدت، باید قبل از استفاده خوب مخلوط شود، از یخ زدن و ذوب مکرر خودداری شود.
بافر ذخیره سازی
20 میلی‌مولار Tris-HCl (pH 8.0)، 150 میلی‌مولار NaCl، 1 میلی‌مولار EDTA، 1 میلی‌مولار DTT، تثبیت‌کننده، گلیسرول 50 درصد.
تعریف واحد
مقدار آنزیم مورد نیاز برای تجزیه 1 میکروگرم DNA تک رشته ای حاوی بازهای dU در 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد 1 واحد است.
کنترل کیفیت
1.خلوص الکتروفورتیک SDS-PAGE بیشتر از 98 درصد
2.حساسیت تقویت، کنترل دسته به دسته، پایداری
3.پس از درمان 1U UNG در دمای 50 درجه سانتیگراد به مدت 2 دقیقه، الگوی حاوی U زیر 103 نسخه باید به طور کامل تخریب شود و هیچ محصول تقویتی نمی تواند تولید شود.
4.بدون فعالیت هسته اگزوژن
دستورالعمل ها
| اجزاء | حجم (μL) | غلظت نهایی |
| 10 × بافر PCR (dNTP free، Mg²+رایگان) | 5 | 1× |
| dUTPs (dCTP، dGTP، dATP) | - | 200 میکرومولار |
| dUTP (جایگزین dTTP) | - | 200-600 میکرومولار |
| 25 میلی‌مولار MgCl2 | 2-8 میکرولیتر | 1-4 میلی متر |
| 5 U/μL Taq | 0.25 | 1.25 U |
| 5 U/μL UNG | 0.25 (0.1-0.5) | 0.25 U (0.1-0.5) |
| 25× مخلوط پرایمرآ | 2 | 1× |
| قالب | - | ＜1μg/واکنش |
| ddH2O | به 50 | - |
توجه داشته باشید: الف: در صورت استفاده برای qPCR/qRT-PCR، پروب فلورسنت باید به سیستم واکنش اضافه شود.معمولاً غلظت نهایی پرایمر 0.2 میکرومولار می تواند نتایج خوبی به همراه داشته باشد.هنگامی که عملکرد واکنش ضعیف است، غلظت آغازگر را می توان در محدوده 0.2-1 میکرومولار تنظیم کرد.معمولاً غلظت پروب در محدوده 0.1-0.3 میکرومولار بهینه می شود.برای یافتن بهترین ترکیب پرایمر و پروب می توان آزمایش های گرادیان غلظت را انجام داد.
یادداشت
1.آنزیم UNG را می توان برای حذف محصولات تقویت dUTP آلوده از سیستم واکنش قبل از واکنش تقویت PCR، سپس برای جلوگیری از نتایج مثبت کاذب به دلیل آلودگی محصول استفاده کرد.
2.دمای بهینه برای آنزیم UNG برای استفاده در واکنش PCR ضد آلودگی معمولاً 50 درجه سانتیگراد برای 2 دقیقه است.شرایط غیرفعال 95 درجه سانتیگراد برای 5 دقیقه است.
3.از یخ زدگی و ذوب مکرر خودداری کنید و در معرض نوسانات زیاد دما قرار نگیرید.
4.ژن های مختلف که باید تکثیر شوند بازده استفاده متفاوتی از dUTP و حساسیت به آنزیم UNG دارند، بنابراین، اگر استفاده از سیستم UNG منجر به کاهش حساسیت تشخیص شود، سیستم واکنش باید تنظیم و بهینه شود، در صورت نیاز به پشتیبانی فنی، لطفاً تماس بگیرید. شرکت ما.
