RTL Reverse Transcriptase
رونوشت معکوس RTL یک DNA پلیمراز وابسته به الگوی RNA است که فاقد فعالیت اگزونوکلئاز 3'→5 است و دارای فعالیت RNase H است.این آنزیم می تواند از RNA به عنوان یک الگو برای سنتز یک رشته مکمل DNA استفاده کند، که می تواند برای سنتز cDNA رشته اول، به ویژه برای RT-LAMP (تقویت همدما با واسطه حلقه) استفاده شود.در مقایسه با RTL ترانس کریپتاز معکوس 1.0، حساسیت به طور قابل توجهی بهبود یافته، پایداری حرارتی قوی تر است، و واکنش در دمای 65 درجه سانتی گراد پایدارتر است.ترانس کریپتاز معکوس RTL (بدون گلیسرول) می تواند برای تهیه آماده سازی لیوفیلیزه، معرف های لیوفیلیزه RT-LAMP و غیره استفاده شود.
تعریف واحد
یک واحد 1 نانومول از dTTP را در مواد قابل رسوب اسیدی در 20 دقیقه در دمای 50 درجه سانتی گراد با استفاده از poly(A)•oligo(dT)25 به عنوان پرایمر الگو ترکیب می کند.
اجزاء
| جزء | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| ترانس کریپتاز معکوس RTL (بدون گلیسرول) (15U/μL) | 0.1 میلی لیتر | 1 میلی لیتر | 10 میلی لیتر |
| بافر 10×HC RTL | 1.5 میلی لیتر | 4×1.5 میلی لیتر | 5×10 میلی لیتر |
| MgSO4 (100 میلی‌مولار) | 1.5 میلی لیتر | 2×1.5 میلی لیتر | 3×10 میلی لیتر |
شرایط نگهداری
حمل و نقل در دمای 0 درجه سانتیگراد و در دمای 25- تا 15 درجه سانتیگراد نگهداری شود.
کنترل کیفیت
- فعالیت باقیمانده ازEاندونوکلئاز:یک واکنش 50 میکرولیتری حاوی 1 میکروگرم λDNA و 15 واحد RTL2.0 که به مدت 16 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شده است، همان الگوی کنترل منفی با الکتروفورز ژل را نشان می دهد.
- فعالیت باقیمانده ازاگزونوکلئاز:یک واکنش 50 میکرولیتری حاوی 1 میکروگرم λDNA هضم شده HindⅢ و 15 واحد RTL2.0 که به مدت 16 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شده است، همان الگوی کنترل منفی را با الکتروفورز ژل نشان می دهد.
- فعالیت باقیمانده ازنیکاز:یک واکنش 50 میکرولیتری حاوی 1 میکروگرم pBR322 سوپرپیچ شده و 15 واحد RTL2.0 که به مدت 4 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شده است، همان الگوی کنترل منفی را با الکتروفورز ژل نشان می دهد.
- فعالیت باقیمانده ازRNase:یک واکنش 10 میکرولیتری حاوی 0.48 میکروگرم MS2 RNA و 15 واحد RTL2.0 که به مدت 4 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شده است، همان الگوی کنترل منفی را با الکتروفورز ژل نشان می دهد.
- E. coli gDNA:اندازه گیری شده باE.coliکیت های تشخیص HCD خاص، 15 واحد RTL2.0 حاوی کمتر از 1 استE. coliژنوم
تنظیم واکنش
پروتکل سنتز cDNA
| اجزاء | جلد |
| الگوی RNA الف | اختیاری |
| Oligo(dT) 18~25 (50uM) یا Random Primer mix (60uM) | 2 میکرولیتر |
| مخلوط dNTP (هر کدام 10 میلی‌مولار) | 1 میکرولیتر |
| مهارکننده RNase (40U/uL) | 0.5 میکرولیتر |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/uL) | 0.5 میکرولیتر |
| بافر 10×HC RTL | 2 میکرولیتر |
| آب بدون هسته | تا 20 میکرولیتر |
یادداشت:
1) دوز توصیه شده RNA توتال 1ng~1μg است
2) دوز توصیه شده mRNA 50ng~100ng بود
ترمو-دوچرخه سواری شرایط برای یک روتین واکنش:
| دما (درجه سانتیگراد) | زمان |
| 25 درجه سانتی گرادa | 5 دقیقه |
| 55 درجه سانتی گراد | 10 دقیقهb |
| 80 درجه سانتی گراد | 10 دقیقه |
یادداشت:
1) در صورت استفاده از مخلوط پرایمر تصادفی، یک مرحله جوجه کشی در دمای 25 درجه سانتیگراد.
2) در صورت استفاده از مخلوط پرایمر هدف، یک مرحله انکوباسیون در دمای 55 درجه سانتیگراد به مدت 10 تا 30 دقیقه.
پروتکل RT-LAMP
| اجزاء | جلد | غلظت نهایی |
| الگوی RNA | اختیاری | ≥10 نسخه |
| dNTP Mix (10mM) | 3.5 میکرولیتر | 1.4 میلی متر |
| پرایمرهای FIP/BIP (25×) | 1 میکرولیتر | 1.6 میکرومولار |
| پرایمرهای F3/B3 (25×) | 1 میکرولیتر | 0.2 میکرومولار |
| آغازگرهای LoopF/LoopB (25×) | 1 میکرولیتر | 0.4 میکرومولار |
| مهارکننده RNase (40U/μL) | 0.5 میکرولیتر | 20 U/واکنش |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/μL) | 0.5 میکرولیتر | 7.5 U/Reaction |
| Bst V2 DNA پلیمراز (8U/μL) | 1 میکرولیتر | 8 U/واکنش |
| MgSO4 (100 میلی‌مولار) | 1.5 میکرولیتر | 6 میلی متر (مجموع 8 میلی متر) |
| بافر 10×HC RTL (یا بافر 10×HC Bst V2) | 2.5 میکرولیتر | 1 × (2 میلی‌مولار Mg2+) |
| آب بدون هسته | تا 25 میکرولیتر | - |
یادداشت:
1) با چرخاندن مخلوط کنید و برای جمع آوری به مدت کوتاهی سانتریفیوژ کنید.انکوباسیون با دمای ثابت در دمای 65 درجه سانتیگراد به مدت 1 ساعت.
2) دو بافر با هم کار می کنند و ترکیب یکسانی دارند.
یادداشت
1. این محصول هنگامی که در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری می شود، یک جامد سفید تشکیل می دهد.آن را از 20- درجه سانتی گراد خارج کرده و حدود 10 دقیقه روی یخ قرار دهید.پس از ذوب، می توان آن را با تکان دادن و مخلوط کردن استفاده کرد.
2. محصول cDNA را می توان در دمای 20- یا 80- درجه سانتی گراد نگهداری کرد یا بلافاصله برای واکنش PCR استفاده کرد.
3. برای جلوگیری از آلودگی RNase، لطفاً ناحیه آزمایش را تمیز نگه دارید و در حین کار از دستکش و ماسک تمیز استفاده کنید.
