کیت مستقیم PCR گیاهی

شماره گربه: HCR2020A

کیت Plant Direct PCR برای تکثیر مستقیم برگ، بذر و غیره گیاه مناسب است و می تواند برای غربالگری با توان بالای نمونه های گیاهی که حاوی پلی ساکارید و پلی فنل نیستند استفاده شود.تکثیر مستقیم DNA پلیمراز بر اساس تکامل هدایت شده دارای تحمل بالاتری نسبت به مهارکننده های PCR در گیاهان است.در عین حال، عملکرد تقویت بالایی را حفظ می کند که برای تکثیر قطعات DNA در 5 کیلوبایت مناسب است.بافر منحصر به فرد Lysis A در کیت را می توان برای لیز کردن بافت های گیاهی تازه یا منجمد استفاده کرد.کار با آن آسان است و لیزات می تواند به عنوان یک الگو برای تقویت بدون خالص سازی استفاده شود.این سیستم حاوی عوامل محافظی است که نمونه‌های خام را قادر می‌سازد تا پس از انجماد و ذوب مکرر به طور موثری تقویت شوند.2× Plant Direct Master Mix فقط نیاز به افزودن پرایمرها و قالب‌ها برای انجام واکنش تقویتی دارد، در نتیجه عملیات پیپ‌ت کردن را کاهش می‌دهد و توان تشخیص و تکرارپذیری نتایج را بهبود می‌بخشد.

اجزاء

*Plant Direct Lysis Buffer B یک معرف اختیاری است که برای خنثی کردن بافر لیز مستقیم کارخانه A برای طولانی کردن زمان نگهداری نمونه ها استفاده می شود.با توجه به شرایط واقعی می توان از آن استفاده کرد.

شرایط نگهداری

2× گیاه مستقیم Master Mix، در دمای -30 تا -15 درجه سانتیگراد نگهداری کنید و از انجماد و ذوب مکرر خودداری کنید.بافر لیز مستقیم گیاه را در دمای -30 تا -15 درجه سانتیگراد یا 2 تا 8 درجه سانتیگراد ذخیره کنید.

فرآیند آزمایش

پردازش نمونه–برگ گیاه

روش مستقیم:استفاده از برگ های جوان توصیه می شود.برای به دست آوردن نمونه کوچک و یکنواخت از یک سوراخ پانچ با قطر ثابت 0.5 تا 3 میلی متر استفاده کنید و سپس نمونه را مستقیماً به سیستم PCR اضافه کنید (سیستم 50 میکرولیتر توصیه می شود).توجه داشته باشید، مطمئن شوید که نمونه در محلول PCR باشد و در مقابل دیواره لوله نباشد.اگر از PCR مستقیم برای تکثیر قطعات طولانی و نمونه های پیچیده استفاده شود، استفاده از نمونه با قطر کمتر (0.5 تا 1 میلی متر) به عنوان الگو می تواند به دستیابی به نتایج بهتر کمک کند.

روش لیز آسیاب:استفاده از برگ های جوان توصیه می شود.یک تکه کوچک برگ (به قطر حدود 1 تا 3 میلی متر) بردارید، آن را در 20 میکرولیتر Plant Direct Lysis Buffer Ab قرار دهید و تا حد امکان آن را آسیاب کنید (این مرحله را می توان با فشردن برگ با نوک پیپت 100 میکرولیتری انجام داد. برای له کردن نمونه).اگر از حجم بیشتری از بافت برگ استفاده می شود (از 7 میلی متر بیشتر نباشد)، حجم بافر رقت را تا 50 میکرولیتر افزایش دهید.پس از آسیاب شدن برگها، محلول باید سبز به نظر برسد.پس از یک سانتریفیوژ کوتاه، 1 میکرولیتر از مایع رویی را به عنوان الگوی واکنش به سیستم PCR اضافه کنید.

روش لیز حرارتی:استفاده از برگ های جوان توصیه می شود.یک تکه کوچک برگ (به قطر حدود 1 تا 3 میلی متر) بردارید، آن را در 20 میکرولیتر بافر لیز مستقیم گیاهی A قرار دهید و آن را در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 5 تا 10 دقیقه گرم کنید.زمان لیز را می توان به طور مناسب برای برگ هایی که لیز کردن آنها دشوار است افزایش داد (بیش از 20 دقیقه).اگر از حجم بیشتری از بافت برگ استفاده می شود (از 7 میلی متر بیشتر نباشد)، حجم بافر رقت را تا 50 میکرولیتر افزایش دهید.پس از حرارت دادن، برای مدت کوتاهی سانتریفیوژ کنید و 1 میکرولیتر مایع رویی را به عنوان الگوی واکنش به سیستم PCR اضافه کنید.

پردازش نمونه- بذر گیاهی

روش لیز آسیاب:از چاقوی جراحی برای برش بذرهایی با قطر 5 میلی متر استفاده کنید، آنها را به 100 میکرولیتر از بافر لیز مستقیم گیاهی A اضافه کنید و نمونه را با نوک پیپت یا ابزارهای دیگر آسیاب کنید.برای مدت کوتاهی ورتکس کنید و بگذارید 3 تا 5 دقیقه در دمای اتاق بماند.مطمئن شوید که نمونه بذر در بافر رقت غوطه ور است.پس از یک سانتریفیوژ کوتاه، 1 میکرولیتر از مایع رویی را به عنوان الگوی واکنش به سیستم PCR اضافه کنید.

روش لیز حرارتی:از چاقوی جراحی برای بریدن بذرهایی با قطر 5 میلی متر استفاده کنید، آنها را به 100 میکرولیتر از بافر لیز مستقیم گیاهی A اضافه کنید و در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 5 تا 10 دقیقه حرارت دهید.زمان لیز را می توان به طور مناسب برای برگ هایی که لیز کردن آنها دشوار است افزایش داد (بیش از 30 دقیقه).پس از حرارت دادن، برای مدت کوتاهی سانتریفیوژ کنید و 1 میکرولیتر مایع رویی را به عنوان الگوی واکنش به سیستم PCR اضافه کنید.

آ.از قیچی یا ابزارهای دیگر نیز می توان برای برش نمونه هایی با اندازه مناسب استفاده کرد.در صورت استفاده مجدد از پانچ یا قیچی، باید قبل از هر بار استفاده با محلول هیپوکلریت سدیم 2 درصد تمیز شوند تا از آلودگی متقاطع بین نمونه ها جلوگیری شود.

بقبل از استفاده مطمئن شوید که بافر گیاهی مستقیم لیز کاملا ذوب شده است.اگر بافر چسبناک باشد یا رسوب داشته باشد، می توان آن را در دمای 37 درجه سانتیگراد گرم کرد تا قبل از استفاده کاملا ذوب شود.

جحجم قالب در سیستم واکنش را می توان با توجه به تفاوت در حجم مواد گیاهی و رقیق کننده اضافه شده به طور مناسب تنظیم کرد.

بافر لیز مستقیم گیاهی

بافر لیز مستقیم گیاهی موجود در این محصول برای آزادسازی ژنوم بیشتر بافت‌های گیاهی کاملاً بهینه شده است و برای نگهداری کوتاه مدت گیاهان خام در دمای 4 درجه سانتیگراد مناسب است.اگر نمونه نیاز به نگهداری طولانی تری دارد (مثلاً 1 تا 2 ماه)، توصیه می شود مایع رویی را به یک لوله EP جدید منتقل کنید و آن را در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری کنید.برای نگهداری پایدارتر نمونه ها، حجم مساوی از بافر لیز مستقیم گیاهی B را به مایع رویی منتقل شده اضافه کنید، خوب مخلوط کنید و در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری کنید.زمان نگهداری پایدار با نمونه‌ها و حالت‌های گیاهی متفاوت است.

سیستم واکنش

آ.حاوی Mg است²⁺در غلظت نهایی 2 میلی مولار.

باستفاده از غلظت نهایی 0.4μM برای هر پرایمر توصیه می شود.استفاده بیش از حد از پرایمرها منجر به افزایش تقویت غیر اختصاصی می شود.

جمقدار نمونه استفاده شده را می توان با توجه به وضعیت واقعی تنظیم کرد.مقدار استفاده شده در یک واکنش نمونه خام لیز شده را می توان بین 2 تا 20 درصد حجم کل واکنش تنظیم کرد.استفاده بیش از حد از نمونه ها می تواند باعث خرابی تقویت شود.

برنامه واکنش

آ.دناتوراسیون اولیه (98 درجه سانتیگراد، 5 دقیقه) لیز بافت گیاه را ترویج می کند و DNA ژنومی را آزاد می کند که می تواند برای تکثیر PCR استفاده شود.زمان را کوتاه یا دما را کاهش ندهید.

بتوصیه می شود آن را برابر با مقدار Tm پرایمر یا 2 ~ 4 ℃ بالاتر از مقدار Tm تنظیم کنید.DNA پلیمراز تقویت مستقیم مورد استفاده در این محصول با Taq DNA پلیمراز معمولی متفاوت است و دارای الزامات ویژه ای برای دمای بازپخت واکنش است؛ استفاده از دمای بازپخت بالا می تواند به طور موثر تقویت غیر اختصاصی را کاهش دهد و راندمان تقویت را بهبود بخشد.برای الگوهای پیچیده، تقویت کارآمد را می توان با تنظیم دمای بازپخت و طولانی کردن زمان گسترش به دست آورد.

جاگر طول محصول تقویتی ≤1 کیلوبایت باشد، زمان افزایش 30 ثانیه بر کیلوبایت تنظیم می شود.اگر طول محصول تقویتی بیش از 1 کیلوبایت باشد، زمان افزایش 60 ثانیه بر کیلوبایت تعیین می شود.

دبرای نمونه‌های پیچیده یا نمونه‌هایی با راندمان تقویت کم، تعداد سیکل‌ها را می‌توان به طور مناسب تا 50-40 سیکل افزایش داد.

برنامه های کاربردی

این برای تکثیر مستقیم بافت های گیاهی و غربالگری با توان بالا نمونه های گیاهی که حاوی پلی ساکارید و پلی فنل نیستند، قابل استفاده است.

یادداشت

فقط برای استفاده تحقیقاتیبرای استفاده در روش های تشخیصی نیست.

1. برای تقویت گیاه خام یا تکثیر مستقیم، توصیه می شود قبل از شروع آزمایش از DNA ژنومی خالص شده به عنوان کنترل مثبت استفاده شود تا از صحت سیستم، آغازگرها و عملیات اطمینان حاصل شود.

2. DNA پلیمراز تقویت مستقیم مورد استفاده در این کیت دارای فعالیت تصحیح قوی است.در صورت نیاز به انجام شبیه سازی TA، توصیه می شود قبل از افزودن آدنین، DNA را خالص سازی کنید.

3. راهنمای طراحی پرایمر：

آ.توصیه می شود که آخرین پایه در انتهای 3' پرایمر باید G یا C باشد.

بباید از عدم تطابق متوالی در 8 پایه آخر در انتهای 3' پرایمر اجتناب شود.جاز ساختارهای سنجاق سر در انتهای ۳ دقیقه پرایمر اجتناب کنید.

دتفاوت در مقدار Tm پرایمر فوروارد و پرایمر معکوس نباید بیشتر از 1℃ باشد و مقدار Tm باید روی 60 ~ 72 ℃ تنظیم شود (پرایمر Premier 5 برای محاسبه مقدار Tm توصیه می شود).

ه.توالی پرایمر اضافی اضافی که با الگو مطابقت ندارند، نباید هنگام محاسبه مقدار Tm پرایمر لحاظ شوند.

f.توصیه می شود که میزان GC پرایمر 40-60 درصد باشد.

g.توزیع کلی A، G، C و T در پرایمر باید تا حد امکان یکنواخت باشد.از استفاده از مناطق با محتوای GC یا AT بالا خودداری کنید.

ساعتاز حضور توالی های مکمل 5 یا بیشتر در داخل پرایمر یا بین دو پرایمر خودداری کنید و از حضور توالی های مکمل 3 یا بیشتر در انتهای 3' دو پرایمر خودداری کنید.

من.از تابع NCBI BLAST برای بررسی ویژگی پرایمر برای جلوگیری از تقویت غیر اختصاصی استفاده کنید.