کیت ژنوتیپ موش
شماره گربه: HCR2021A
این محصول یک کیت طراحی شده برای شناسایی سریع ژنوتیپ های موش، از جمله استخراج خام DNA و سیستم تقویت PCR است.این محصول را می توان برای تقویت PCR مستقیماً از دم، گوش، انگشت پا و سایر بافت های موش پس از برش ساده توسط Lysis Buffer و Proteinase k استفاده کرد.بدون هضم یک شبه، استخراج فنل-کلروفرم یا خالص سازی ستون، که ساده است و زمان بر بودن آزمایش ها را کوتاه می کند.این محصول برای تکثیر قطعات هدف تا 2 کیلو بایت و واکنش های مالتی پلکس PCR با حداکثر 3 جفت پرایمر مناسب است.مخلوط 2×Mouse Tissue Direct PCR Mix حاوی DNA پلیمراز مهندسی شده ژنتیکی، Mg است.2+، dNTP ها و یک سیستم بافر بهینه برای ارائه راندمان تقویت بالا و تحمل بازدارنده، به طوری که واکنش های PCR را می توان با افزودن قالب و پرایمرها و آبرسانی مجدد محصول به 1× انجام داد.محصول PCR تقویت شده با این محصول دارای یک پایه برجسته "A" در انتهای 3 ' است و می تواند به طور مستقیم برای شبیه سازی TA پس از خالص سازی استفاده شود.
اجزاء
| جزء | اندازه |
| 2×ماوس Tissue Direct PCR Mix | 5×1.0 میلی لیتر |
| لیز بافر | 2×20 میلی لیتر |
| پروتئیناز K | 800 میکرولیتر |
شرایط نگهداری
محصولات باید در دمای -25 ~ -15 درجه سانتیگراد به مدت 2 سال نگهداری شوند.پس از ذوب، بافر Lysis را می توان برای استفاده چندگانه کوتاه مدت در دمای 2 تا 8 درجه سانتیگراد ذخیره کرد و هنگام استفاده خوب مخلوط کرد.
کاربرد
این محصول برای آنالیز ناک اوت موش، تشخیص تراریخته، ژنوتیپ و غیره مناسب است.
امکانات
1.عملیات ساده: بدون نیاز به استخراج DNA ژنومی.
2.کاربرد گسترده: مناسب برای تقویت مستقیم بافت های مختلف ماوس.
دستورالعمل ها
1.انتشار DNA ژنومی
1) تهیه لیزات
لیز بافت با توجه به تعداد نمونه‌های موشی که باید لیز شوند تهیه می‌شود (لیز بافت باید در محل با توجه به دوز تهیه شود و برای استفاده کاملاً مخلوط شود) و نسبت معرف‌های مورد نیاز برای یک نمونه به شرح زیر است:
| اجزاء | حجم (μL) |
| پروتئیناز K | 4 |
| لیز بافر | 200 |
2) آماده سازی نمونه و لیز
استفاده از بافت توصیه شده
| نوعی ازبافت | حجم توصیه شده |
| دم موش | 1-3 میلی متر |
| گوش موش | 2-5 میلی متر |
| انگشت پا موش | 1-2 عدد |
مقدار مناسبی از نمونه‌های بافت موش را در لوله‌های سانتریفیوژ تمیز بگیرید، 200 میکرولیتر لیزات بافت تازه را به هر لوله سانتریفیوژ اضافه کنید، ورتکس کنید و تکان دهید، سپس در دمای 55 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه انکوبه کنید و سپس در دمای 98 درجه سانتیگراد به مدت 3 دقیقه حرارت دهید.
3) سانتریفیوژ
لیزات را به خوبی تکان دهید و با سرعت 12000 دور در دقیقه به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ کنید.مایع رویی را می توان به عنوان الگو برای تقویت PCR استفاده کرد.اگر قالب برای ذخیره سازی مورد نیاز است، مایع رویی را به لوله سانتریفیوژ استریل دیگری منتقل کنید و به مدت 2 هفته در دمای -20 درجه سانتیگراد نگهداری کنید.
2.تقویت PCR
مخلوط 2×Mouse Tissue Direct PCR را از 20- درجه سانتیگراد خارج کرده و روی یخ ذوب کنید، وارونه مخلوط کنید و سیستم واکنش PCR را مطابق جدول زیر آماده کنید (روی یخ عمل کنید):
| اجزاء | 25μLسیستم | 50μLسیستم | غلظت نهایی |
| 2×ماوس Tissue Direct PCR Mix | 12.5 میکرولیتر | 25 میکرولیتر | 1× |
| پرایمر 1 (10μM) | 1.0 میکرولیتر | 2.0 میکرولیتر | 0.4μM |
| پرایمر 2 (10μM) | 1.0 میکرولیتر | 2.0 میکرولیتر | 0.4μM |
| محصول برشa | همانطور که نیاز است | همانطور که نیاز است |
|
| ddH2O | تا 25 میکرولیتر | تا 50 میکرولیتر |
|
توجه داشته باشید:
الف) مقدار اضافه شده نباید از 1/10 سیستم بیشتر شود و اگر بیش از حد اضافه شود، ممکن است از تقویت PCR جلوگیری شود.
شرایط PCR توصیه شده
| مرحله چرخه | دما | زمان | چرخه ها |
| دناتوراسیون اولیه | 94 درجه سانتیگراد | 5 دقیقه | 1 |
| دناتوره سازی | 94 درجه سانتیگراد | 30 ثانیه | 35-40 |
| آنیل کردنa | Tm+3~5℃ | 30 ثانیه | |
| افزونه | 72 درجه سانتیگراد | 30 ثانیه در کیلوبایت | |
| تمدید نهایی | 72 درجه سانتیگراد | 5 دقیقه | 1 |
| - | 4℃ | نگه دارید | - |
توجه داشته باشید:
الف) دمای بازپخت: با توجه به مقدار Tm پرایمر، توصیه می شود دمای بازپخت را روی مقدار Tm کوچکتر پرایمر +3~5 ℃ تنظیم کنید.
مشکلات و راه حل های رایج
1.بدون نوارهای هدفمند
1) محصول لیز بیش از حد.مناسب ترین مقدار الگو را انتخاب کنید، معمولاً بیش از 1/10 سیستم نیست.
2) حجم نمونه خیلی بزرگمحلول لیز را 10 بار رقیق کنید و سپس تکثیر کنید یا حجم نمونه را کاهش دهید و دوباره لیز کنید.
3) نمونه های بافت تازه نیستند.توصیه می شود از نمونه های بافت تازه استفاده شود.
4) کیفیت پرایمر ضعیف.از DNA ژنومی برای تکثیر برای تایید کیفیت پرایمر و بهینه سازی طراحی پرایمر استفاده کنید.
2.تقویت غیر اختصاصی
1) دمای بازپخت خیلی کم و تعداد چرخه خیلی زیاد است.دمای بازپخت را افزایش دهید و تعداد چرخه ها را کاهش دهید.
2) غلظت الگو خیلی زیاد است.پس از تقویت، مقدار قالب را کاهش دهید یا قالب را 10 بار رقیق کنید.
3) ویژگی پرایمر ضعیف.طراحی پرایمر را بهینه کنید.
یادداشت
1.برای جلوگیری از آلودگی متقاطع بین نمونه‌ها، باید ابزارهای نمونه‌گیری متعددی تهیه شود و در صورت نیاز به استفاده مکرر، سطح ابزارها را می‌توان با محلول هیپوکلریت سدیم 2 درصد یا پاک‌کننده اسید نوکلئیک پس از هر نمونه‌برداری تمیز کرد.
2.توصیه می‌شود از دستمال‌های تازه موش استفاده کنید و حجم نمونه‌گیری نباید خیلی زیاد باشد تا تأثیری بر نتایج تقویت نداشته باشد.
3.بافر Lysis باید از ذوب مکرر یخ زدگی جلوگیری کند و می تواند در دمای 2 تا 8 درجه سانتیگراد برای استفاده چندگانه کوتاه مدت نگهداری شود.اگر در دمای پایین نگهداری شود، ممکن است بارش رخ دهد و باید قبل از استفاده کاملاً حل شود.
4.مخلوط PCR باید از یخ زدگی و ذوب مکرر جلوگیری کند و می تواند در دمای 4 درجه سانتیگراد برای استفاده مکرر کوتاه مدت نگهداری شود.
5.این محصول فقط برای تحقیقات علمی تجربی است و نباید در تشخیص یا درمان بالینی استفاده شود.
