آنزیم های UDG/UNG
UDG (اوراسیل DNA گلیکوزیلاز) می تواند هیدرولیز پیوند N-گلیکوزیدی بین پایه اوراسیل و ستون فقرات قند فسفات در ssDNA و dsDNA را کاتالیز کند.این می تواند به راحتی آلودگی هوا را کنترل کند و برای سیستم های زیست شناسی مولکولی رایج مانند PCR، qPCR، RT-qPCR و LAMP مناسب است.
مشخصات فنی
| میزبان بیان | E. coli نوترکیب با ژن اوراسیل DNA گلیکوزیلاز |
| وزن مولکولی | 24. 8 کیلو دالتون |
| خلوص | ≥95٪ (SDS-PAGE) |
| غیر فعال سازی حرارتی | 95 درجه سانتیگراد، 5 تا 10 دقیقه |
| تعریف واحد | یک واحد (U) به عنوان مقدار آنزیمی است که برای کاتالیز هیدرولیز L μg dU حاوی dsDNA در 30 دقیقه در دمای 25 درجه سانتیگراد لازم است. |
ذخیره سازی
این محصول باید در دمای 25-15 درجه سانتیگراد به مدت دو سال نگهداری شود.
دستورالعمل ها
1.آماده سازی مخلوط واکنش PCR طبق سیستم زیر
| اجزاء | حجم (μL) | غلظت نهایی |
| بافر 10×PCR (Mg² + پلاس) | 5 | 1× |
| 25 mmol/LMgCl | 3 | 1.5 میلی مول در لیتر |
| dUTP (10 میلی مول در لیتر) | 3 | 0.6 میلی مول در لیتر |
| dCTP/dGTP/dATP/dTTP(10mmol/Leach) | 1 | 0.2 میلی مول / لیچ |
| DNA الگو | X | - |
| Primer1 (10μmol/L) | 2 | 0.4 میکرومول در لیتر |
| پرایمر 2 (10μmol/L) | 2 | 0.4 میکرومول در لیتر |
| Taq DNA Polymerase (5 U/μL) | 0. 5 | 0. 05 U/μL |
| اوراسیل DNA گلیکوزیلاز (UDG/UNG)، 1 U/μL | 1 | 1 U/μL |
| ddH2O | حداکثر تا 50 | - |
توجه داشته باشید: با توجه به الزامات تجربی، غلظت نهایی dUTP را می توان بین 0.2-0.6 mmol / L تنظیم کرد و 0.2 mmol / L dTTP را می توان انتخابی اضافه کرد.
2.روش تقویت
| مرحله چرخه | درجه حرارت | زمان | چرخه ها |
| تخریب الگوی حاوی dU | 25 درجه سانتیگراد | 10 دقیقه | 1 |
| فعال سازی UDG، دناتوره سازی اولیه الگو | 95 درجه سانتیگراد | 5 تا 10 دقیقه | 1 |
| دناتوره سازی | 95 درجه سانتیگراد | 10 ثانیه |
30-35 |
| آنیل کردن | 60 درجه سانتیگراد | 20 ثانیه | |
| افزونه | 72 درجه سانتیگراد | 30 ثانیه در کیلوبایت | |
| تمدید نهایی | 72 درجه سانتیگراد | 5 دقیقه | 1 |
توجه داشته باشید: زمان واکنش در 25 درجه سانتیگراد را می توان در عرض 5-10 دقیقه با توجه به نیازهای آزمایشی تنظیم کرد.
یادداشت
1.UDG در اکثر بافرهای واکنش PCR فعال است.
2.آنزیم ها باید در یک جعبه یخ یا حمام یخ در هنگام استفاده نگهداری شوند و بلافاصله پس از استفاده باید در دمای 20 درجه سانتیگراد نگهداری شوند.
3.لطفاً برای اطمینان از سلامت و ایمنی خود، تجهیزات حفاظتی لازم، مانند کت و دستکش آزمایشگاهی را بپوشید!
