M-MLV Neoscript Reverse Transcriptase
ترانس کریپتاز معکوس نئواسکریپت یک ترانس کریپتاز معکوس است که با غربالگری جهش ژن M-MLV منشأ و بیان ویروس لوسمی موشی مولونی در E.coli به دست می آید.این آنزیم فعالیت RNase H را حذف می کند، تحمل دمایی بالاتری دارد و برای رونویسی معکوس در دمای بالا مناسب است.بنابراین، برای از بین بردن اثرات نامطلوب ساختار سطح بالای RNA و عوامل غیر اختصاصی بر سنتز cDNA مفید است و دارای ثبات بالاتر و توانایی سنتز رونویسی معکوس است.این آنزیم دارای ثبات بالاتر و توانایی سنتز رونویسی معکوس است.
اجزاء
1.200 U/μL Neoscript Reverse Transcriptase
2.5 × بافر رشته اول (اختیاری)
* بافر 5 × رشته اول حاوی dNTP نیست، لطفاً هنگام تهیه سیستم واکنش، dNTP ها را اضافه کنید.
برنامه پیشنهادی
1.qRT-PCR یک مرحله ای.
2.تشخیص ویروس RNA
شرایط نگهداری
-20 درجه سانتیگراد برای نگهداری طولانی مدت، باید قبل از استفاده خوب مخلوط شود، از یخ زدن و ذوب مکرر خودداری شود.
تعریف واحد
یک واحد دارای 1 نانومول dTTP در 10 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد با استفاده از poly(A)•oligo(dT) است.25به عنوان الگو / آغازگر.
کنترل کیفیت
1.خلوص الکتروفورتیک SDS-PAGE بیشتر از 98٪.
2.حساسیت تقویت، کنترل دسته به دسته، پایداری.
3.بدون فعالیت هسته اگزوژن، بدون آلودگی آندونوکلئاز خارجی یا اگزونوکلئاز
راه‌اندازی واکنش برای اولین راه‌حل واکنش زنجیره‌ای
1.آماده سازی مخلوط واکنش
| اجزاء | جلد |
| الیگو(dT)12-18 آغازگر یا Random Primerآ یا پرایمرهای اختصاصی ژنb | 50 pmol |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2 pmol | |
| 10 میلی متر dNTP | 1 میکرولیتر |
| الگوی RNA | کل RNA≤ 5μg.mRNA≤ 1 میکروگرم |
| dH بدون RNase2O | تا 10 میکرولیتر |
یادداشت:a/b: لطفاً انواع مختلف پرایمرها را با توجه به نیازهای آزمایشی خود انتخاب کنید.
2.به مدت 5 دقیقه در دمای 65 درجه سانتیگراد حرارت داده و به مدت 2 دقیقه به سرعت روی یخ سرد کنید.
3.اجزای زیر را به حجم 20 میکرولیتر به سیستم فوق اضافه کنید و به آرامی مخلوط کنید:
| اجزاء | جلد (μL) |
| 5 × بافر اول رشته | 4 |
| Neoscript Reverse Transcriptase (200 U/μL) | 1 |
| مهارکننده RNase (40 U/μL) | 1 |
| dH بدون RNase2O | تا 20 میکرولیتر |
4-لطفاً واکنش را با توجه به شرایط زیر انجام دهید:
(1) در صورت استفاده از پرایمر تصادفی، واکنش باید در دمای 25 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه و سپس در دمای 50 درجه سانتیگراد به مدت 30 تا 60 دقیقه انجام شود.
(2) اگر Oligo dT یا پرایمرهای خاص استفاده شود، واکنش باید در دمای 50 درجه سانتیگراد به مدت 30 تا 60 دقیقه انجام شود.
5.در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه حرارت دهید تا نئواسکریپت رونوشت معکوس غیرفعال شود و واکنش خاتمه یابد.
6.محصولات رونویسی معکوس را می توان مستقیماً در واکنش PCR و واکنش کمی فلورسانس PCR استفاده کرد یا برای مدت طولانی در دمای -20 درجه سانتیگراد نگهداری کرد.
PCR Rاقدام：
1.آماده سازی مخلوط واکنش
| اجزاء | تمرکز |
| بافر 10 × PCR (بدون dNTP، Mg² + رایگان) | 1× |
| dNTP (هر dNTP 10 میلی‌مولار) | 200 میکرومولار |
| 25 میلی‌مولار MgCl2 | 1-4 میلی متر |
| Taq DNA Polymerase (5U/μL) | 2-2.5 U |
| پرایمر 1 (10 میکرومولار) | 0.2-1 میکرومولار |
| پرایمر 2 (10 میکرومولار) | 0.2-1 میکرومولار |
| قالبآ | ≤10٪ محلول اولین واکنش زنجیره ای (2 میکرولیتر) |
| ddH2O | تا 50 میکرولیتر |
یادداشت:الف: اگر مقدار زیادی محلول واکنش زنجیره اول اضافه شود، واکنش PCR ممکن است مهار شود.
2.روش واکنش PCR
| گام | درجه حرارت | زمان | چرخه ها |
| پیش دناتوراسیون | 95 درجه سانتیگراد | 2-5 دقیقه | 1 |
| دناتوره سازی | 95 درجه سانتیگراد | 10-20 ثانیه | 30-40 |
| آنیل کردن | 50-60 ℃ | 10-30 ثانیه | |
| افزونه | 72 درجه سانتیگراد | 10-60 ثانیه |
یادداشت
1.مناسب برای بهینه سازی دمای رونویسی معکوس در محدوده 42℃~55℃.
2.این پایداری بهتری دارد، برای تقویت رونویسی معکوس در دمای بالا مناسب است.علاوه بر این، برای عبور مؤثر از مناطق ساختاری پیچیده RNA مطلوب است.همچنین، آنبرای تشخیص RT-PCR کمی فلورسانس مالتی پلکس یک مرحله ای مناسب است.
3.سازگاری خوبی با آنزیم های مختلف تقویت کننده PCR دارد و برای واکنش های RT-PCR با حساسیت بالا مناسب است.
4.مناسب برای واکنش کمی فلورسانس یک مرحله ای RT-PCR با حساسیت بالا، به طور موثر نرخ تشخیص غلظت پایین الگوها را بهبود می بخشد.
5.مناسب برای ساخت کتابخانه cDNA.
