UNG حساس به دما
UNG حساس به دما (TS-UNG) از بیان نوترکیب در E. coli به دست می آید.این آنزیم آزادسازی اوراسیل آزاد را از DNA تک رشته ای و دو رشته ای حاوی اوراسیل کاتالیز می کند و در برابر RNA غیر فعال است.در مقایسه با آنزیم معمولی UNG با منشاء ژن E. coli، آنزیم TS-UNG در دماهای پایین (20 ℃ ~ 37 درجه سانتیگراد) فعالیت بالاتری دارد و به دما حساس است و به راحتی غیرفعال می شود (50 درجه سانتیگراد) و از تخریب تقویت حاوی dUTP جلوگیری می کند. محصولات در دمای اتاق با فعالیت باقی مانده ای که ممکن است پس از غیرفعال شدن آنزیم معمولی UNG باقی بماند.بنابراین، آنزیم TS-UNG نه تنها برای واکنش پیشگیری از آلودگی PCR مناسب است، بلکه به خوبی با برنامه تقویت RT-PCR مطابقت دارد و می تواند در واکنش پیشگیری از آلودگی RT-PCR استفاده شود.
برنامه پیشنهادی
تقویت پیشگیری از آلودگی
شرایط نگهداری
-20 درجه سانتیگراد برای نگهداری طولانی مدت، باید قبل از استفاده خوب مخلوط شود، از یخ زدن و ذوب مکرر خودداری شود.
بافر ذخیره سازی
20 میلی‌مولار Tris-HCl (pH 7.5)، 100 میلی‌مولار NaCl، 0.1 میلی‌مولار EDTA، 1 میلی‌مولار DTT، تثبیت‌کننده، گلیسرول 50 درصد.
تعریف واحد
مقدار آنزیم مورد نیاز برای تجزیه 1 میکروگرم از DNA تک رشته ای حاوی بازهای dU در 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد 1 واحد فعالیت (U) است.
کنترل کیفیت
1.خلوص الکتروفورتیک SDS-PAGE بیشتر از 98 درصد
2.فعالیت تخریب، کنترل دسته به دسته، پایداری
3.بدون فعالیت نوکلئاز اگزوژن، بدون آلودگی آندونوکلئاز اگزونوکلئاز یا اگزونوکلئاز.
دستورالعمل ها
| اجزاء | حجم (μL) | غلظت نهایی |
| 10 × بافر PCR (بدون dNTP، Mg²+رایگان) | 5 | 1× |
| dUTPs (dCTP، dGTP، dATP) | - | 200 میکرومولار |
| dUTP (جایگزین dTTP) | - | 200-600 میکرومولار |
| 25 میلی‌مولار MgCl2 | 2-8 میکرولیتر | 1-4 میلی متر |
| 5 U/μL Taq | 0.25 | 1.25 U |
| 1 U/μLTS-UNG | 0.5 (0.1-0.5) | 0.5 U (0.1-0.5U) |
| 25× مخلوط پرایمرآ | 2 | 1× |
| قالب | - | ＜1μg/واکنش |
| ddH2O | به 50 | - |
نکته: الف: در صورت استفاده برای qPCR/qRT-PCR، پروب فلورسنت باید به سیستم واکنش اضافه شود.معمولاً غلظت نهایی پرایمر 0.2 میکرومولار می تواند نتایج خوبی به همراه داشته باشد.هنگامی که عملکرد واکنش ضعیف است، غلظت آغازگر را می توان در محدوده 0.2-1 میکرومولار تنظیم کرد.معمولاً غلظت پروب در محدوده 0.1-0.3 میکرومولار بهینه می شود.برای یافتن بهترین ترکیب پرایمر و پروب می توان آزمایش های گرادیان غلظت را انجام داد.
یادداشت
1.دمای واکنش بهینه آنزیم TS-UNG نسبتا پایین است و می توان آن را در محدوده 20 ℃ ~ 37 ℃ بهینه کرد، دوز آنزیم و زمان واکنش را می توان در محدوده 0.1 ~ 0.5 U، 5 ~ بهینه کرد. 10 دقیقه؛و آنزیم می تواند در فرآیند رونویسی معکوس غیرفعال شود.
2.برای جلوگیری از آلودگی برای PCR و RT-PCR مناسب است.
3.از یخ زدگی و ذوب مکرر خودداری کنید و در معرض نوسانات زیاد دما قرار نگیرید.
4.ژن های مختلف که باید تکثیر شوند بازده استفاده متفاوتی از dUTP و حساسیت به آنزیم UNG دارند، بنابراین، اگر استفاده از سیستم UNG منجر به کاهش حساسیت تشخیص شود، سیستم واکنش باید تنظیم و بهینه شود، در صورت نیاز به پشتیبانی فنی، لطفاً تماس بگیرید. شرکت ما.
