پروتئیناز K NGS (پودر)
شماره گربه: HC4507A
NGS پروتئاز K یک پروتئاز سرین پایدار با فعالیت آنزیمی بالا و ویژگی سوبسترای وسیع است. این آنزیم ترجیحاً پیوندهای استری و پیوندهای پپتیدی مجاور ترمینال C اسیدهای آمینه آبگریز، اسیدهای آمینه حاوی گوگرد و اسیدهای آمینه آروماتیک را تجزیه می کند.بنابراین، اغلب برای تجزیه پروتئین ها به پپتیدهای کوتاه استفاده می شود.NGS پروتئاز K یک پروتئاز سرین معمولی با Asp است39-خود69-سر224سه گانه کاتالیزوری که منحصر به پروتئازهای سرین است و مرکز کاتالیزوری توسط یدک کش کلسیم احاطه شده است.2+محل های اتصال برای تثبیت، حفظ فعالیت آنزیم بالا در طیف وسیع تری از شرایط.
مشخصات
| ظاهر | پودر آمورف سفید تا مایل به سفید، لیوفیلیزه |
| فعالیت خاص | ≥40U/mg جامد |
| DNase | هیچ کدام شناسایی نشد |
| RNase | هیچ کدام شناسایی نشد |
| بار زیستی | ≤50CFU/g جامد |
| باقی مانده اسید نوکلئیک | <5 pg/mg جامد |
خواص
| منبع | آلبوم Tritirachium |
| شماره EC | 3.4.21.64(نوترکیب از آلبوم Tritirachium) |
| وزن مولکولی | 29 کیلو دالتون (SDS-PAGE) |
| نقطه ایزوالکتریک | 7.81 شکل.1 |
| pH بهینه | 7.0-12.0 (همه فعالیت بالایی دارند) شکل 2 |
| دمای بهینه | 65 ℃ شکل 3 |
| ثبات pH | pH 4.5-12.5 (25℃,16h) شکل.4 |
| پایداری حرارتی | زیر 50 ℃ (pH 8.0، 30 دقیقه) شکل 5 |
| پایداری ذخیره سازی | ذخیره شده در دمای 25 درجه سانتیگراد به مدت 12 ماه شکل.6 |
| فعال کننده ها | SDS، اوره |
| بازدارنده ها | دی ایزوپروپیل فلوروفسفات؛بنزیل سولفونیل فلوراید |
شرایط نگهداری
پودر لیوفیلیزه را در دمای -25-15 ℃ برای مدت طولانی دور از نور نگهداری کنید.پس از انحلال، مقدار مناسبی برای ذخیره سازی کوتاه مدت در دمای 2-8 درجه سانتیگراد دور از نور یا ذخیره سازی طولانی مدت در -25-~-15 ℃ دور از نور به مقدار مناسب در نظر بگیرید.
موارد احتیاط
هنگام استفاده یا وزن کردن از دستکش و عینک محافظ استفاده کنید و پس از استفاده به خوبی تهویه کنید.این محصول ممکن است باعث واکنش آلرژیک پوستی و تحریک جدی چشم شود.در صورت استنشاق، ممکن است باعث آلرژی یا علائم آسم یا تنگی نفس شود.ممکن است باعث تحریک تنفسی شود.
تعریف واحد
یک واحد NGS پروتئاز K به عنوان مقدار آنزیم مورد نیاز برای هیدرولیز کازئین به 1 میکرومول L-تیروزین در شرایط تعیین استاندارد تعریف می شود.
آماده سازی معرف ها
| معرف | سازنده | کاتالوگ |
| فنی کازئیناز شیر گاو | سیگما آلدریچ | C7078 |
| NaOH | سینوفارم شیمیاییReagent Co., Ltd. | 10019762 |
| NaH2PO4· 2 ساعت2O | سینوفارم شیمیاییReagent Co., Ltd. | 20040718 |
| Na2HPO4 | سینوفارم شیمیاییReagent Co., Ltd. | 20040618 |
| تری کلرواستیک اسید | سینوفارم شیمیاییReagent Co., Ltd. | 80132618 |
| استات سدیم | سینوفارم شیمیاییReagent Co., Ltd. | 10018818 |
| استیک اسید | سینوفارم شیمیاییReagent Co., Ltd. | 10000218 |
| HCl | سینوفارم شیمیاییReagent Co., Ltd. | 10011018 |
| کربنات سدیم | سینوفارم شیمیاییReagent Co., Ltd. | 10019260 |
| فولین-فنل | Sangon Biotech (شانگهای)شرکت با مسئولیت محدود | A500467-0100 |
| ال-تیروزین | سیگما | 93829 |
معرف I:
بستر: 1% کازئین از محلول شیر گاو: 1 گرم کازئین شیر گاو را در 50 میلی لیتر محلول فسفات سدیم 0.1 مولار، pH 8.0 حل کنید، در حمام آب در دمای 70-65 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه حرارت دهید، هم بزنید و حل کنید، با آب سرد کنید، تنظیم کنید. هیدروکسید سدیم تا PH 8.0 و تا 100 میلی لیتر رقیق شود.
معرف II:
محلول TCA: 0.1M تری کلرواستیک اسید، 0.2M استات سدیم و 0.3M اسید استیک (وزن 1.64 گرم اسید تری کلرواستیک + 1.64 گرم استات سدیم + 1.724 میلی لیتر اسید استیک متوالی، 50 میلی لیتر آب یونیزه شده اضافه کنید، با pH 4 رقیق شده و در HCl 0 تنظیم کنید. 100 میلی لیتر).
معرف III:
محلول کربنات سدیم 0.4 متر (وزن 4.24 گرم کربنات سدیم بی آب و حل کردن در 100 میلی لیتر آب)
معرف IV:
معرف فولین فنل: 5 بار با آب دیونیزه رقیق می شود.
معرف V:
رقیق کننده آنزیم: محلول فسفات سدیم 0.1 مولار، pH 8.0.
معرف VI:
محلول استاندارد L-تیروزین: 0، 0.005، 0.025، 0.05، 0.075، 0.1، 0.25 umol/ml L-تیروزین محلول با 0.2M HCl.
روش
1. اسپکتروفتومتر UV-Vis را روشن کنید و اندازه گیری فتومتریک را انتخاب کنید.
2. طول موج را 660 نانومتر تنظیم کنید.
3. حمام آب را روشن کنید، دما را روی 37 درجه سانتیگراد تنظیم کنید، اطمینان حاصل کنید که دما برای 3-5 دقیقه بدون تغییر است.
4. 0.5 میلی لیتر بستر را در یک لوله سانتریفیوژ 2 میلی لیتری در حمام آب 37 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه از قبل گرم کنید.
5. 0.5 میلی لیتر محلول آنزیم رقیق شده را به مدت 10 دقیقه در لوله سانتریفیوژ از قبل گرم شده خارج کنید.رقیق کننده آنزیم را به عنوان گروه خالی تنظیم کنید.
6. بلافاصله پس از واکنش 1.0 میلی لیتر معرف TCA اضافه کنید.خوب مخلوط کنید و به مدت 30 دقیقه در حمام آب قرار دهید.
7. محلول واکنش سانتریفیوژ کنید.
8. اجزای زیر را به ترتیب مشخص شده اضافه کنید.
| معرف | جلد |
| رویی | 0.5 میلی لیتر |
| 0.4M کربنات سدیم | 2.5 میلی لیتر |
| معرف فولین فنل | 0.5 میلی لیتر |
9. قبل از انکوباتور در حمام آب 37 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه خوب مخلوط کنید.
10. OD660به عنوان OD تعیین شد1;گروه شاهد بلانک: رقیق کننده آنزیمی به جای محلول آنزیمی برای تعیین OD استفاده می شود660به عنوان OD2، ΔOD=OD1-OD2.
11. منحنی استاندارد L-تیروزین: 0.5 میلی لیتر محلول L-تیروزین با غلظت های مختلف، 2.5 میلی لیتر کربنات سدیم 0.4 مولار، 0.5 میلی لیتر معرف فولین فنل در لوله سانتریفیوژ 5 میلی لیتر، انکوبه در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه، تشخیص OD660برای غلظت های مختلف L-تیروزین، سپس منحنی استاندارد Y=kX+b به دست آمد، که در آن Y غلظت L-تیروزین است، X OD است.600.
محاسبه
2: حجم کل محلول واکنش (میلی لیتر)
0.5: حجم محلول آنزیمی (میلی لیتر)
0.5: حجم مایع واکنش مورد استفاده در تعیین کروموژنیک (mL)
10: زمان واکنش (دقیقه)
Df: رقیق سازی چندگانه
C: غلظت آنزیم (mg/mL)
ارقام
شکل 1 باقیمانده DNA
| نمونه | خ C4 | اسید نوکلئیک بازیابی (pg/mg) | بهبود(٪) | توتال نوکلئیک اسید ( pg/mg) |
| PRK | 24.66 | 2.23 | 83% | 2.687 |
| PRK+STD2 | 18.723 | 126.728 | - | - |
| STD1 | 12.955 |
- |
- |
- |
| STD2 | 16 | |||
| STD3 | 19.125 | |||
| STD4 | 23.135 | |||
| STD5 | 26.625 | |||
| H2O بدون RNA | نامشخص | - | - | - |
شکل 2 pH بهینه
شکل 3 دمای بهینه
شکل 4 ثبات pH
شکل 5 پایداری حرارتی
شکل 6 پایداری ذخیره سازی در 25 ℃
