M-MLV ترانس کریپتاز معکوس
RevScript ترانس کریپتاز معکوس با فناوری مهندسی ژنتیک به دست می آید.دارای توانایی سنتز cDNA، پایداری حرارتی و محدودیت دمای واکنش (تا 60 درجه سانتیگراد) بالاتر است.محصول cDNA سنتز شده تا 10 کیلوبایت است.این ترکیب میل قالب ها را افزایش می دهد و برای رونویسی معکوس الگوهای RNA با ساختار ثانویه پیچیده یا ژن های کم کپی مناسب است.
اجزاء
جزء | HC2003B (10000U) | HC2003B (5*10000U) | HC2003B (200000U) |
RevScript Reverse Transcriptase (200U/μL) | 50 میکرولیتر | 5×50 میکرولیتر | 1 میلی لیتر |
بافر 5 × RevScript | 250 میکرولیتر | 1.25 میلی لیتر | 5 میلی لیتر |
شرایط نگهداری
این محصول باید در دمای 25- تا 15- درجه سانتیگراد به مدت 2 سال نگهداری شود.
تعریف واحد
یک واحد 1 نانومول از dTTP را در مواد نامحلول در اسید در 10 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی گراد با استفاده از Oligo(dT) به عنوان آغازگر ترکیب می کند.
تنظیم واکنش
1.دناتورهسازی الگوی RNA (این مرحله اختیاری است، دناتورهسازی الگوی RNA به باز کردن ساختارهای ثانویه کمک میکند، که بازده cDNA رشته اول را بهبود میبخشد.)
اجزاء | جلد (μL) |
ddH بدون RNase2O | به 13 |
الیگو(dT)18 (50 میکرومول در لیتر) یا پرایمر تصادفی (50 میکرومول در لیتر) یا پرایمرهای اختصاصی ژن (2 میکرومول در لیتر) | 1 |
یا 1 | |
یا 1 | |
الگوی RNA | X a |
یادداشت:
1) a: RNA کل: 1-5 ug یا mRNA: 1-500 نانوگرم
2) در دمای 65 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه جوجه کشی کنید، سپس بلافاصله روی یخ قرار دهید تا به مدت 2 دقیقه خنک شود.سانتریفیوژ مختصر برای جمع آوری مایع واکنش، محلول واکنش رونویسی معکوس را همانطور که در جدول زیر نشان داده شده است اضافه کنید.به آرامی پیپت کنید تا مخلوط شود.
1.آماده سازی مخلوط واکنش (حجم 20 میکرولیتر)
اجزاء | جلد (μL) |
مخلوط مرحله قبل | 13 |
5×بافر | 4 |
dNTP Mix (10nmol/L) | 1 |
ترانس کریپتاز معکوس (U/μL 200) | 1 |
مهارکننده RNase (40 U/μL) | 1 |
1.واکنش را در شرایط زیر انجام دهید:
دما (درجه سانتیگراد) | زمان |
25 درجه سانتی گرادa | 5 دقیقه |
42 درجه سانتی گرادb | 15-30 دقیقه |
85 درجه سانتی گرادc | 5 دقیقه |
یادداشت:
1) الف.انکوباسیون در دمای 25 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه فقط برای استفاده از هگزامرهای تصادفی مورد نیاز است.لطفاً هنگام استفاده از Oligo (dT) این مرحله را نادیده بگیرید18یا Gene Specific Primer.
2) ب.دمای رونویسی معکوس توصیه شده 42 درجه سانتیگراد است، برای الگوهای با ساختارهای ثانویه پیچیده یا محتوای GC بالا، توصیه می شود دمای واکنش را به 50-55 درجه سانتیگراد افزایش دهید.
3) ج.حرارت دادن در 85 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه برای غیرفعال کردن ترانس کریپتاز معکوس.
4) محصول را می توان مستقیماً در واکنش های PCR یا qPCR استفاده کرد یا در دمای 20- درجه سانتی گراد برای نگهداری کوتاه مدت نگهداری کرد.برای نگهداری طولانی مدت توصیه می شود محصولات را در 80- درجه سانتیگراد نگهداری کنید.از انجماد و ذوب مکرر خودداری کنید.
5) محصول برای RT-qPCR یک مرحله ای مناسب است، توصیه می شود برای هر سیستم واکنش 25 میکرولیتری 10-20 U ترانس کریپتاز معکوس اضافه کنید یا به تدریج مقدار ترانس کریپتاز معکوس را با توجه به وضعیت واقعی افزایش دهید.
یادداشت
1.لطفاً منطقه آزمایشی را تمیز نگه دارید.در حین کار باید از دستکش و ماسک تمیز استفاده شود.تمام مواد مصرفی مورد استفاده در آزمایش باید فاقد RNase باشد تا از آلودگی RNase جلوگیری شود.
2.تمام مراحل باید روی یخ انجام شود تا از تخریب RNA جلوگیری شود.
3.نمونه های RNA با کیفیت بالا برای اطمینان از راندمان بالای رونویسی معکوس توصیه می شود.
4.این محصول فقط برای استفاده تحقیقاتی است.
5.لطفا برای ایمنی خود با کت های آزمایشگاهی و دستکش های یکبار مصرف کار کنید.