کیت Maxi Plasmid EndoFree
این کیت برای استخراج از 150 تا 300 میلی‌لیتر محلول باکتریایی کشت شده در طول شب با استفاده از روش لیز قلیایی SDS بهبودیافته برای لیز باکتری مناسب است.عصاره خام به طور انتخابی با یک پاک کننده اندوتوکسین منحصر به فرد ترکیب می شود و با سانتریفیوژ برای حذف اندوتوکسین ها جدا می شود.سپس غشای سیلیکاژل به طور انتخابی به DNA پلاسمید در محلول تحت شرایط نمک بالا و pH پایین متصل می شود.به دنبال آن بافر شستشو برای حذف ناخالصی ها و سایر اجزای باکتریایی اضافه می شود.در نهایت، یک بافر شستشوی کم نمک و pH بالا برای شستشوی DNA پلاسمید خالص از غشای ماتریکس سیلیکون استفاده می شود.غشاء سیلیکاژل از غشای جذب ویژه استفاده می کند و تفاوت مقدار جذب بین ستون و ستون بسیار کم است و تکرارپذیری خوب است.فنل، کلروفرم و سایر معرفهای سمی مورد نیاز نیستند و مراحل رسوب اتانول نیز لازم نیست.این کیت می تواند برای استخراج سریع 0.2 تا 1.5 میلی گرم DNA پلاسمید خالص با کپی بالا، با نرخ استخراج 80٪ -90٪ استفاده شود.این کیت از یک فرمول فرآیند منحصر به فرد استفاده می کند که اندوتوکسین را حذف می کند، محتوای اندوتوکسین بسیار کم است و اثر انتقال سلولی عالی است.پلاسمید استخراج‌شده می‌تواند مستقیماً در هضم آنزیمی، PCR، رونویسی آزمایشگاهی، تبدیل، توالی‌یابی و سایر آزمایش‌های زیست‌شناسی مولکولی استفاده شود.
شرایط نگهداری
RNaseA باید در دمای -30 تا -15 درجه سانتیگراد ذخیره شود و در دمای ≤0 ℃ حمل شود.
اندوتوکسین Scavenger را می توان در دمای 2 تا 8 درجه سانتیگراد به مدت یک ماه نگهداری کرد و در دمای 30- تا 15- درجه سانتیگراد برای نگهداری طولانی مدت نگهداری کرد.و در دمای ≤0℃ حمل می شود.
سایر اجزاء باید در دمای اتاق (15 ~ 25 درجه سانتیگراد) ذخیره شده و در دمای اتاق حمل و نقل شوند.
اجزاء
| اجزاء | 10RXNS |
| RNase A | 750 میکرولیتر |
| بافر P1 | 75 میلی لیتر |
| بافر P2 | 75 میلی لیتر |
| بافر P4 | 75 میلی لیتر |
| پاک کننده اندوتوکسین | 25 میلی لیتر |
| بافر PW | 2 × 22 میلی لیتر |
| بافر سل | 20 میلی لیتر |
| ستون‌های FastPure DNA Maxi (هر کدام در یک لوله 50 میلی‌لیتری) | 10 |
| لوله کلکسیونی بدون اندوتوکسین | 2×5 |
RNaseA:10 میلی گرم در میلی لیتر، برای حذف RNA استفاده می شود.
بافر P1:بافر سوسپانسیون باکتریایی، RNaseA را قبل از اولین استفاده به بافر P1 اضافه کنید.
بافر P2:بافر لیز باکتریایی (حاوی SDS/NaOH).
بافر P4:بافر خنثی کننده
پاک کننده اندوتوکسین:به طور موثر اندوتوکسین را از عصاره پلاسمید خام حذف می کند.
بافر PW:بافر شستشو، حجم تعیین شده اتانول را قبل از اولین استفاده اضافه کنید.
بافر سل:بافر شستشو
ستون های FastPure DNA Maxi:ستون های جذب DNA پلاسمید
لوله های مجموعه 50 میلی لیتر:لوله های جمع آوری فیلتر
لوله جمع آوری بدون اندوتوکسین:لوله های جمع آوری DNA پلاسمید
مواد آماده شده
اتانول مطلق، ایزوپروپانول، لوله های سانتریفیوژ 50 میلی لیتری ته گرد و 50 میلی لیتر بدون اندوتوکسینلوله های سانتریفیوژ
برنامه های کاربردی
این محصول برای استخراج پلاسمید در مقیاس بزرگ از 150 تا 300 میلی لیتر محلول باکتریایی مناسب است.یک شبه کشت داده شود
فرآیند آزمایش
1. 150 تا 200 میلی لیتر (حداکثر 300 میلی لیتر) از محلول باکتریایی که در طول شب کشت داده شده است را بردارید و سانتریفیوژ کنید.حدود 11000 دور در دقیقه (12000 × گرم) برای 1 تا 2 دقیقه.مایع رویی را دور بریزید و باکتری ها را جمع آوری کنید.
Δ هنگام جمع آوری بیش از 50 میلی لیتر محلول باکتریایی، باکتری ها را می توان با افزودن محلول باکتریایی، سانتریفوژ، دور ریختن مایع رویی و سایر مراحل در همان لوله 50 میلی لیتری جمع آوری کرد.
چندین بار.
2. 7.5 میلی لیتر بافر P1 (لطفا بررسی کنید آیا RNaseA به بافر P1 اضافه شده است) را به سانتریفیوژ اضافه کنید.لوله حاوی باکتری باشد و با گرداب یا پیپتینگ کاملاً مخلوط شود.
Δ تعلیق مجدد کامل باکتری در این مرحله برای تولید بسیار مهم است و پس از تعلیق مجدد نباید هیچ توده باکتریایی وجود داشته باشد.اگر توده‌های باکتریایی وجود داشته باشد که کاملاً مخلوط نشده باشند، بر لیز تأثیر می‌گذارد و در نتیجه عملکرد و خلوص پایینی ایجاد می‌شود.اگر OD600 محلول باکتری 0.65 باشد، توصیه می شود که 7.5 میلی لیتر از بافر P1 هنگام استخراج از 150 میلی لیتر محلول باکتری استفاده شود.هنگامی که OD600 0.75 است، باید 8 میلی لیتر از بافر P1 استفاده شود و حجم بافر P2 و P4 باید متناسب با آن تغییر کند.اگر حجم محلول باکتری به 200 میلی لیتر افزایش یابد، توصیه می شود کهحجم بافرهای P1، P2 و P4 به نسبت افزایش می یابد.
3. 7.5 میلی لیتر بافر P2 را از مرحله 2 به سوسپانسیون باکتریایی اضافه کنید و به آرامی بالا و پایین به مدت 6 تا 8 مخلوط کنید.بارها و در دمای اتاق به مدت 4 تا 5 دقیقه انکوبه کنید.
Δ به آرامی برعکس کنید تا کاملا مخلوط شوند.گرداب باعث تکه تکه شدن DNA ژنومی و در نتیجه قطعات DNA ژنومی در پلاسمید استخراج شده می شود.در این زمان محلول چسبناک و شفاف می شود و نشان می دهد که باکتری ها به طور کامل لیز شده اند.مدت زمان برای جلوگیری از تخریب پلاسمیدها نباید بیش از 5 دقیقه باشد.اگر محلول شفاف نباشد، ممکن است تعداد زیادی باکتری ایجاد شودلیز ناقص است، بنابراین مقدار باکتری باید به طور مناسب کاهش یابد.
4. 7.5 میلی لیتر بافر P4 را از مرحله 3 به سوسپانسیون باکتریایی اضافه کنید و بلافاصله 6 تا 8 بار به آرامی معکوس کنید تا محلول به طور کامل بافر P2 را خنثی کند.در این زمان، رسوب لخته سفید رنگ باید ظاهر شود.در بیش از 11000 دور در دقیقه (12000 × گرم) به مدت 10 تا 15 دقیقه سانتریفیوژ کنید، مایع رویی را به دقت در یک لوله سانتریفیوژ 50 میلی لیتری ته گرد جدید (خود آماده) بریزید و از آن اجتناب کنید.رسوب سفید شناور را آسپیره کنید.
Δ بافر P4 را اضافه کنید و بلافاصله آن را برعکس کنید تا خوب مخلوط شود.لوله را بگذارید بماند تا رسوب سفید به طور یکنواخت در سرتاسر محلول توزیع شود تا از تولید بارندگی موضعی که می‌تواند بر خنثی‌سازی اثر بگذارد جلوگیری شود.اگر قبل از سانتریفیوژ، رسوب لخته سفید یکنواخت وجود نداشته باشد و مایع رویی پس از سانتریفیوژ مشخص نباشد، لوله می تواند5 دقیقه دیگر سانتریفیوژ شد.
5. 0.1 برابر حجم (10 درصد حجم مایع رویی، حدود 2.2 میلی لیتر) اندوتوکسین اسکاونجر را از مرحله 4 به مایع رویی اضافه کنید و آن را معکوس کنید تا مخلوط شود.محلول را به مدت 5 دقیقه در حمام یخ قرار دهید یا داخل یخ خرد شده (یا یخچال فریزر) قرار دهید تا زمانی که محلول از کدر به شفاف و شفاف (یا ثابت) تبدیل شود.کمی کدر) و گهگاه چندین بار مخلوط کنید.
Δ پس از اضافه شدن اندوتوکسین Scavenger به مایع رویی، مایع رویی کدر می شود امامایع رویی باید پس از سرد شدن در حمام یخ شفاف (یا کمی کدر) شود.
6. پس از اینکه مایع رویی به مدت 10 تا 15 دقیقه در دمای اتاق (> 25 درجه سانتیگراد) قرار گرفت، کدر می شود.دمای آن تا دمای اتاق افزایش می یابد.سپس مایع رویی باید وارونه شود تا مخلوط شود.
Δ اگر دمای اتاق پایین تر است یا می خواهید زمان استخراج را کاهش دهید، مایع رویی را می توان در یک حمام آب 37 ~ 42 ℃ به مدت 5 تا 10 دقیقه انکوبه کرد و مرحله بعدی را می توان پس از مایع رویی انجام داد.کدر می شود
7. مایع رویی را در حدود 11000 دور در دقیقه (12000 × گرم) به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق سانتریفیوژ کنید تا فاز جدا شود.فاز آبی بالایی حاوی DNA است در حالی که لایه فاز روغنی آبی پایین حاوی اندوتوکسین و سایر ناخالصی ها است.انتقال دهیدفاز آبی حاوی DNA به یک لوله جدید ولایه روغنی را دور بریزید.
Δ دما در طول سانتریفیوژ باید بیش از 25 درجه سانتیگراد باشد زیرا جداسازی فاز موثر نیستاگر دما خیلی پایین باشد رخ می دهد.
Δ اگر جداسازی فاز موثر نباشد، دمای سانتریفیوژ را می توان تا 30 درجه سانتیگراد تنظیم کرد وزمان سانتریفیوژ را می توان تا 15 دقیقه افزایش داد.
Δ لایه روغنی آبی را نمکید زیرا حاوی اندوتوکسین و سایر ناخالصی ها است.
سازوکار
Resuspension Lysis Neutralization
◇ 7.5 میلی لیتر بافر P1 اضافه کنید
◇ 7.5 میلی لیتر بافر P2 اضافه کنید
◇ 7.5 میلی لیتر بافر P4 اضافه کنید
حذف اندوتوکسین
◇0.1 برابر حجم مایع رویی اندوتوکسین اسکاونجر اضافه کنید
صحافی و شستشو
◇ 0.5 برابر حجم ایزوپروپانول اضافه کنید
◇ 10 میلی لیتر بافر PW اضافه کنید
◇ 10 میلی لیتر بافر PW اضافه کنید
شستشو
◇ 1 تا 2 میلی لیتر بافر سل یا ddH2O بدون اندوتوکسین اضافه کنید
