مینی کیت استخراج DNA
این کیت از سیستم بافر بهینه و فن آوری خالص سازی ستون سیلیکاژل استفاده می کند که می تواند قطعات DNA 70 جفت باز تا 20 کیلوبایت را از غلظت های مختلف ژل آگارز TAE یا TBE بازیابی کند.ستون جذب DNA می تواند به ویژه DNA را در شرایط پر نمک جذب کند.علاوه بر این، این کیت می‌تواند مستقیماً قطعات DNA را از محصولات PCR، سیستم‌های واکنش آنزیمی یا محصولات DNA خام بدست‌آمده با روش‌های دیگر خالص‌سازی کند و ناخالصی‌هایی مانند پروتئین‌ها، سایر ترکیبات آلی، یون‌های نمک معدنی و پرایمرهای الیگونوکلئوتیدی را حذف کند.می تواند اطمینان حاصل کند که تصفیه می تواند در 10-15 دقیقه کامل شود.DNA خالص را می توان به طور مستقیم برای بستن، تبدیل، هضم آنزیم، رونویسی آزمایشگاهی، PCR، توالی یابی، میکرواینجکشن و غیره استفاده کرد.
شرایط نگهداری
در دمای -15 تا -25 درجه سانتیگراد نگهداری کنید و در دمای اتاق حمل کنید.
اجزاء
| اجزاء | (100 rxns) |
| بافر تولید ناخالص داخلی | 80 میلی لیتر |
| بافر GW | 2 × 20 میلی لیتر |
| بافر شستشو | 20 میلی لیتر |
| FastPure DNA Mini Columns-G | 100 |
بافر تولید ناخالص داخلی:بافر اتصال DNA
بافر GW:بافر شستشو؛قبل از استفاده، اتانول مطلق را با حجم مشخص شده روی بطری اضافه کنید.
بافر شستشو:شستشو.
FastPure DNA Mini Columns-G:ستون های جذب DNA
لوله های مجموعه 2 میلی لیتر:لوله های جمع آوری برای فیلتر.
مواد آماده شده
لوله های استریل شده 1.5 میلی لیتری، اتانول مطلق و ایزوپروپانول (وقتی قطعه DNA ≤100 جفت باز است، 1 حجم اضافه کنید.
ایزوپروپانول به ژل 1 حجمی)، حمام آب.
فرآیند آزمایش
قبل از استفاده، 80 میلی لیتر اتانول را به بافر GW رقیق کنید، همانطور که روی برچسب نشان داده شده است، در دمای اتاق نگهداری کنید.
سازوکار
1. محلول واکنش PCR
طرح استخراج ژل: طرح بازیابی محلول واکنش PCR بافر GDP با حجم برابر را اضافه کنید:5 برابر حجم بافر اضافه کنید
2. تولید ناخالص داخلی حجم ژل را محاسبه کنید (100 μl برابر با 100 میلی گرم)
ژل را حل کنید
3. از قبل روی 50 تا 55 گرم کنید℃
4. Bind Wash
اضافه کردن 300 میکرولیتر تولید ناخالص داخلی بافر*
700 میکرولیتر بافر GW اضافه کنید
700 میکرولیتر بافر GW اضافه کنید
5. الوت
20 تا 30 میکرولیتر بافر شستشو یا آب دیونیزه شده اضافه کنید
نکات * بازیابی مایع واکنش PCR بدون این مرحله
برنامه استخراج ژل
1. پس از الکتروفورز DNA برای تکه تکه کردن قطعات DNA، تک نوار قطعه DNA را از ژل آگارز زیر نور UV جدا کنید.توصیه می شود از کاغذ جاذب برای جذب رطوبت ظاهری ژل استفاده کنید و با حذف آگارز اضافی تا حد امکان، اندازه برش ژل را به حداقل برسانید.برش ژل (بدون لوله میکرو سانتریفیوژ) را برای محاسبه حجم آن وزن کنید: حجم ژل 100 میلی گرمی تقریباً 100 میکرولیتر است، با فرض اینکه چگالی آن 1 گرم در میلی لیتر است.
2. حجم برابر بافر GDP را اضافه کنید، در دمای 50 تا 55 درجه سانتیگراد به مدت 7-10 دقیقه انکوبه کنید (با توجه به اندازه ژل، زمان جوجه کشی را تنظیم کنید تا ژل کاملاً حل شود).در طول انکوباسیون، لوله را 2 بار معکوس کنید.
Δ افزودن 1-3 حجم بافر GDP بر کارایی بازیابی DNA تأثیری نخواهد داشت.اگر قطعه DNA که باید بازیابی شود کمتر از 100 جفت باز است، باید 3 حجم از تولید ناخالص داخلی بافر اضافه شود.وقتی تکه ژل کاملا حل شد، 1 حجم ایزوپروپانول اضافه کنید و کاملا مخلوط کنید، سپس به مرحله بعد ادامه دهید.
3. سانتریفیوژ کوتاهی انجام دهید تا نمونه به انتهای لوله برسد، FastPure DNA Mini Columns-G را در لوله های مجموعه 2 میلی لیتری قرار دهید، محلول را با دقت حداکثر 700 میکرولیتر یک بار در روز انتقال دهید.
زمان رسیدن به ستون های فیلتراسیون، در 12000 دور در دقیقه (13800 x گرم) به مدت 30-60 ثانیه سانتریفیوژ کنید.
4. فیلتر را دور بیندازید و 300 میکرولیتر Buffer GDP را به ستون اضافه کنید، در دمای اتاق به مدت 1 دقیقه انکوبه کنید، سانتریفیوژ کنید با 12000 دور در دقیقه (13800 x g) به مدت 30-60 ثانیه.
5. فیلتر را دور بیندازید و 700 میکرولیتر بافر GW (بررسی کنید که آیا اتانول مطلق از قبل اضافه شده است یا خیر!) به ستون اضافه کنید، با سرعت 12000 دور در دقیقه (گرم 13800) به مدت 30-60 ثانیه سانتریفیوژ کنید.
Δ لطفاً بافر GW را در اطراف دیواره ستون جذب اضافه کنید، یا پوشش پشتی بافر GW را اضافه کنید و آن را 2 تا 3 بار وارونه مخلوط کنید تا نمک چسبیده به دیواره لوله کاملاً شسته شود.
6. مرحله 5 را تکرار کنید.
Δ شستشو با بافر GW دو بار می تواند اطمینان حاصل کند که نمک به طور کامل حذف شده و تأثیر آزمایشات بعدی را از بین می برد.
7. فیلتر را دور بریزید و ستون خالی را با 12000 دور در دقیقه (13800 x گرم) به مدت 2 دقیقه سانتریفیوژ کنید.
8. ستون را در یک لوله میکرو سانتریفیوژ 1.5 میلی لیتری تمیز قرار دهید، 20 تا 30 میکرولیتر Elution Buffer را به مرکز غشای ستون اضافه کنید، به مدت 2 دقیقه انکوبه کنید و سپس با سرعت 12000 دور در دقیقه (13800 x گرم) به مدت 1 دقیقه سانتریفیوژ کنید.ستون را دور بیندازید، DNA به دست آمده را در 20- نگهداری کنید.
Δ انتقال مایع رویی مرحله 8 به ستون برای شستشوی مجدد و پیش گرم کردن بافر شستشو تا 55 (وقتی قطعه DNA > 3 کیلوبایت باشد) ممکن است برای افزایش کارایی بازیابی مفید باشد.
برنامه بازیابی محصولات PCR
این پروتکل برای خالص سازی قطعات DNA از محصولات PCR، سیستم واکنش آنزیمی و سایر محصولات خام DNA (از جمله DNA ژنتیکی) قابل استفاده است.این محلول می تواند نوکلئوتیدهای مختلف، آغازگرها، دایمرهای آغازگر، مولکول های نمک، آنزیم ها و سایر ناخالصی ها را به طور موثر حذف کند.
1. محصولات PCR، محلول واکنش آنزیمی و سایر محصولات خام DNA را به طور خلاصه سانتریفیوژ کنید.حجم آنها را با پیپت تخمین زده و به یک لوله 1.5 یا 2 میلی لیتری استریل شده منتقل کنید.ddH2O را تا حجم 100 میکرولیتر اضافه کنید.در حالی که برای DNA ژنومی با غلظت بالا، رقیق کردن تا 300 میکرولیتر با ddH2O به بهبود کارایی بازیابی کمک می کند.
2. 5 جلد از بافر تولید ناخالص داخلی را اضافه کنید، با معکوس کردن یا گرداب زدن کاملاً مخلوط کنید.اگر قطعه DNA مورد نظر > 100 جفت باز باشد، باید 1.5 حجم اضافی (نمونه + تولید ناخالص داخلی بافر) اتانول اضافه شود.
3. ستون را دوباره در لوله جمع آوری قرار دهید، مخلوط را به ستون منتقل کنید، با 12000 دور در دقیقه (13800 × گرم) به مدت 30 تا 60 ثانیه سانتریفیوژ کنید.اگر حجم محلول مخلوط بیش از 700 میکرولیتر است، ستون جذب را دوباره در لوله جمع آوری قرار دهید، محلول باقیمانده را به ستون جذب انتقال دهید و در 12000 دور در دقیقه (13800 × گرم) به مدت 30 تا 60 ثانیه سانتریفیوژ کنید.
4. عملکرد بعدی به مرحله 5 – 8 از برنامه استخراج 08- 1/Gel اشاره دارد.
برنامه های کاربردی
غلظت های مختلف ژل آگارز TAE یا TBE.محصولات PCR، سیستم های واکنش آنزیمی یا سایر محصولات خام DNA که با روش های مختلف به دست می آیند.قطعات بازیابی شده در محدوده70 جفت باز -20 کیلوبایت.
یادداشت
فقط برای استفاده تحقیقاتیبرای استفاده در روش های تشخیصی نیست.
1. 80 میلی لیتر اتانول را به بافر GW رقیق کنید، همانطور که روی برچسب قبل از استفاده نشان داده شده است، در دمای اتاق نگهداری کنید.
2. اگر بافر تولید ناخالص داخلی به راحتی در طول ذخیره سازی در دمای پایین رسوب می کند، می توان آن را برای مدتی قبل از استفاده در دمای اتاق قرار داد.در صورت لزوم می توان آن را در یک حمام آب 37 درجه سانتیگراد از قبل گرم کرد تا رسوب کاملاً حل شود و پس از مخلوط کردن می توان از آن استفاده کرد.
3. دمای حمام آب را از قبل روی 50 ~ 55 درجه سانتیگراد تنظیم کنید.
4. در مرحله 1 برنامه استخراج 08-1/ژل، به حداقل رساندن اندازه برش ژل به طور قابل توجهی زمان انحلال را کاهش می دهد و کارایی بازیابی را افزایش می دهد (DNA خطی شده به راحتی هیدرولیز می شود زمانی که به طور مداوم در دمای بالا قرار می گیرد).ژل DNA را برای مدت طولانی در معرض اشعه ماوراء بنفش قرار ندهید، زیرا نور ماوراء بنفش می تواند باعث آسیب DNA شود.
5. ژل را در مرحله 2 برنامه استخراج 08- 1/Gel به طور کامل حل کنید، در غیر این صورت راندمان بازیابی DNA به طور جدی تحت تأثیر قرار می گیرد.
6. بافر شستشو یا ddH2O را تا 55 درجه سانتیگراد گرم کنید، که برای بهبود کارایی شستشوی DNA مفید است.توصیه می شود DNA را در شوینده 2.5 میلی مولار Tris-HCl، pH 7.0 تا 8.5 ذخیره کنید.
