آنزیم پوشاننده ویروس واکسینیا
آنزیم پوشاننده ویروس واکسینیا از سویه نوترکیب E. coli که حامل ژن های آنزیم پوشاننده واکسنیا است مشتق شده است.این آنزیم منفرد از دو زیر واحد (D1 و D12) تشکیل شده و دارای سه فعالیت آنزیمی (RNA تری فسفاتاز و گوانیلیل ترانسفراز توسط زیر واحد D1 و گوانین متیل ترانسفراز توسط زیر واحد D12) می باشد.آنزیم پوشاننده ویروس واکسینیا برای کاتالیز کردن تشکیل ساختار کلاهک موثر است، که می تواند به طور خاص ساختار کلاهک 7 متیل گوانیلات (m7Gppp، Cap 0) را به انتهای 5' RNA متصل کند.ساختار کلاهک (Cap 0) نقش مهمی در تثبیت mRNA، انتقال و ترجمه در یوکاریوت ها دارد.پوشاندن RNA توسط واکنش آنزیمی یک روش موثر و ساده است که می تواند به طور قابل توجهی پایداری و ترجمه RNA را برای رونویسی، ترانسفکشن و میکرواینجکشن in vitro بهبود بخشد.
اجزاء
آنزیم پوشاننده ویروس واکسینیا (10 U/μL)
10× درپوش بافر
شرایط نگهداری
-25 ~- 15 ℃ برای ذخیره سازی (از تکرار چرخه های انجماد و ذوب خودداری کنید).
بافر ذخیره سازی
20 میلیمولار Tris-HCl (pH 8.0)، 100 میلیمولار NaCl،
1 میلیمولار DTT، 0. 1 میلیمولار EDTA، 0. 1 درصد تریتون X- 100، 50 درصد گلیسرول.
تعریف واحد
یک واحد آنزیم پوشاننده ویروس واکسینیا به عنوان مقدار آنزیم مورد نیاز برای ترکیب 10pmol GTP در یک رونوشت 80nt در 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد تعریف می شود.
کنترل کیفیت
اگزونوکلئاز:10 واحد از آنزیم پوشاننده ویروس واکسینیا با 1 میکروگرم DNA هضم λ-Hind III در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 16 ساعت هیچ گونه تخریبی را که توسط الکتروفورز ژل آگارز تعیین شد، ایجاد نمی کند.
اندونوکلئاز:10 واحد آنزیم پوشاننده ویروس واکسینیا با 1μg λDNA در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 16 ساعت هیچگونه تخریبی را که توسط الکتروفورز ژل آگارز تعیین شد، ایجاد نمی کند.
Nickase:10 واحد آنزیم پوشاننده ویروس واکسینیا با 1 میکروگرم pBR322 در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 16 ساعت هیچگونه تخریبی را که توسط الکتروفورز ژل آگارز تعیین شد، ایجاد نمی کند.
RNase:10 واحد از آنزیم پوشاننده ویروس واکسینیا با 1.6 میکروگرم MS2 RNA به مدت 4 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد، همانطور که توسط الکتروفورز ژل آگارز تعیین شد، هیچ تخریبی ایجاد نمی کند.
1.coli DNA:10U از آنزیم پوشاننده ویروس واکسینیا برای حضور DNA ژنومی E. coli با استفاده از TaqMan qPCR با پرایمرهای اختصاصی برای مکان E. coli 16S rRNA غربالگری میشود.آلودگی DNA ژنومی E. coli ≤1 ژنوم E. coli است.
2.باکتریایی اندوتوکسین: تست LAL، مطابق با نسخه 2020 فارماکوپه چینی IV، روش تست حد ژل، قانون کلی (1143).محتوای اندوتوکسین باکتریایی باید ≤10 EU/mg باشد.
سیستم و شرایط واکنش
1. پروتکل دربندی (حجم واکنش: 20 میکرولیتر)
این روش برای واکنش پوشاندن 10 میکروگرم RNA (≥100 nt) قابل استفاده است و میتوان آن را با توجه به نیازهای تجربی مقیاسبندی کرد.
I) 10μg RNA و H2O بدون نوکلئاز را در یک لوله میکروفیوژ 1.5 میلی لیتری به حجم نهایی 15.0 میکرولیتر ترکیب کنید.*10×Capping Buffer: 0.5M Tris-HCl، 50 mM KCl، 10 mm MgCl2، 10 mm DTT، (25℃، pH 8.0)
2) به مدت 5 دقیقه در دمای 65 درجه سانتیگراد و سپس 5 دقیقه حمام یخ را حرارت دهید.
3) اجزای زیر را به ترتیب مشخص شده اضافه کنید
Cجزء | Vعلوفه |
RNA دناتوره شده (≤10μg، طول ≥100 nt) | 15 میکرولیتر |
10× بافر درپوش* | 2 میکرولیتر |
GTP (10 میلی متر) | 1 میکرولیتر |
SAM (2 میلی متر) | 1 میکرولیتر |
آنزیم پوشاننده ویروس واکسینیا (10U/μL) | 1 میکرولیتر |
* بافر درپوش 10: 0.5 مولار Tris-HCl، 50 میلیمولار KCl، 10 میلیمولار MgCl2، 10 میلیمولار DTT، (25℃، pH8.0)
4) در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه انکوبه کنید، RNA اکنون درپوش است و برای کاربردهای پایین دست آماده است.
2. ترمینال 5′ واکنش برچسب زدن (حجم واکنش: 20 میکرولیتر)
این پروتکل برای نشانگذاری RNA حاوی تری فسفات 5 طراحی شده است و میتوان آن را بر اساس خواستهها افزایش داد.کارایی ادغام برچسب تحت تأثیر نسبت مولی RNA: GTP و همچنین محتوای GTP در نمونههای RNA خواهد بود.
1) مقدار مناسب RNA و H2O بدون نوکلئاز را در یک لوله میکروفیوژ 1.5 میلی لیتری به حجم نهایی 14.0 میکرولیتر ترکیب کنید.
2) به مدت 5 دقیقه در دمای 65 درجه سانتیگراد و سپس 5 دقیقه حمام یخ حرارت دهید.
3) اجزای زیر را به ترتیب مشخص شده اضافه کنید.
Cجزء | Vعلوفه |
RNA دناتوره شده | 14 میکرولیتر |
10× درپوش بافر | 2 میکرولیتر |
ترکیب GTP** | 2 میکرولیتر |
SAM (2 میلی متر) | 1 میکرولیتر |
آنزیم پوشاننده ویروس واکسینیا (10U/μL) | 1 میکرولیتر |
** GTP MIX به GTP و تعداد کمی از نشانگرها اشاره دارد.برای غلظت GTP مراجعه کنیدبه تبصره 3.
4) در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه جوجه کشی کنید، انتهای RNA 5' اکنون برچسب گذاری شده و برای پایین دست آماده است.
برنامه های کاربردی
1. درپوش mRNA قبل از سنجش ترجمه / ترجمه در شرایط آزمایشگاهی
2. برچسب گذاری انتهای 5' mRNA
نکاتی در مورد استفاده
1.حرارت دادن محلول RNA قبل از انکوباسیون با آنزیم پوشاننده واکسینیا، ساختار ثانویه در انتهای 5 رونوشت را حذف می کند.زمان را به 60 دقیقه برای رونوشت هایی با انتهای 5' بسیار ساختار یافته افزایش دهید.
2. RNA مورد استفاده برای واکنش های پوشاندن باید قبل از استفاده خالص شده و در آب بدون نوکلئاز معلق شود.EDTA نباید وجود داشته باشد و محلول باید عاری از نمک باشد.
3. برای برچسب زدن انتهای 5'، غلظت کل GTP باید حدود 1-3 برابر غلظت مولی mRNA در واکنش باشد.
4. حجم سیستم واکنش را می توان با توجه به واقعی کاهش یا افزایش داد.