PNGase F
پپتید-N-گلیکوزیداز F(PNGase F) موثرترین روش آنزیمی برای حذف تقریباً تمام اولیگوساکاریدهای مرتبط با N از گلیکوپروتئین ها است.PNGase F یک آمیداز است که بین باقی مانده‌های داخلی GlcNAc و آسپاراژین مانوز بالا، هیبرید و الیگوساکاریدهای پیچیده از گلیکوپروتئین‌های مرتبط با N می‌شکافد.
کاربرد
این آنزیم برای حذف باقی مانده های کربوهیدرات از پروتئین ها مفید است.
آماده سازی و مشخصات
| ظاهر | مایع بی رنگ |
| خلوص پروتئین | ≥95٪ (از SDS-PAGE) |
| فعالیت | ≥500000 U/ml |
| اگزوگلیکوزیداز | هیچ فعالیتی شناسایی نشد (ND) |
| اندوگلیکوزیداز F1 | ND |
| اندوگلیکوزیداز F2 | ND |
| اندوگلیکوزیداز F3 | ND |
| اندوگلیکوزیداز H | ND |
| پروتئاز | ND |
خواص
| شماره EC | 3.5.1.52(نوترکیب از میکروارگانیسم) |
| وزن مولکولی | 35 کیلو دالتون (SDS-PAGE) |
| نقطه ایزوالکتریک | 8. 14 |
| pH بهینه | 7.0-8.0 |
| دمای بهینه | 65 درجه سانتی گراد |
| ویژگی بستر | شکستن پیوندهای گلیکوزیدی بین باقی مانده های GlcNAc و آسپاراژین شکل.1 |
| سایت های شناسایی | گلیکان های متصل به N مگر اینکه حاوی α1-3 فوکوز باشند شکل 2 |
| فعال کننده ها | DTT |
| بازدارنده | SDS |
| دمای ذخیره سازی | -25 ~ -15 ℃ |
| غیر فعال سازی حرارتی | مخلوط واکنش 20 میکرولیتری حاوی 1 میکرولیتر PNGase F با انکوباسیون در دمای 75 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه غیرفعال می شود. |
شکل 1 ویژگی بستر PNGase F
شکل 2 تشخیص PNGase F می نشیند.
هنگامی که باقی مانده های داخلی GlcNAc به فوکوز α1-3 متصل می شوند، PNGase F نمی تواند الیگوساکاریدهای مرتبط با N را از گلیکوپروتئین ها جدا کند.این اصلاح در گیاهان و برخی از گلیکوپروتئین های حشرات رایج است.
Cاجزاء
|
| اجزاء | تمرکز |
| 1 | PNGase F | 50 میکرولیتر |
| 2 | 10× بافر دناتوره کننده گلیکوپروتئین | 1000 میکرولیتر |
| 3 | 10×گلیکوبوفر 2 | 1000 میکرولیتر |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 میکرولیتر |
تعریف واحد
یک واحد (U) به عنوان مقدار آنزیم مورد نیاز برای حذف بیش از 95 درصد کربوهیدرات از 10 میکروگرم RNase B دناتوره شده در 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد در حجم کل واکنش 10 میکرولیتر تعریف می شود.
شرایط واکنش
1. 1-20 میکروگرم گلیکوپروتئین را با آب دیونیزه حل کنید، 1 میکرولیتر بافر دناتوره کننده 10×گلیکوپروتئین و H2O (در صورت لزوم) اضافه کنید تا حجم کل واکنش 10 میکرولیتر به دست آید.
2.در دمای 100 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه انکوبه کنید و روی یخ خنک کنید.
3.2 میکرولیتر 10×GlycoBuffer 2، 2 µl 10% NP-40 را اضافه کرده و مخلوط کنید.
4.1-2 میکرولیتر PNGase F و H اضافه کنید2O (در صورت لزوم) تا 20 میکرولیتر حجم کل واکنش ایجاد شود و مخلوط شود.
5.واکنش را در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 60 دقیقه انکوبه کنید.
6.برای آنالیز SDS-PAGE یا آنالیز HPLC.
