mRNA Cap2'-O-Methyltransferase

mRNA Cap 2' -O-methyltransferase از سویه نوترکیب E. coli که حامل ژن mRNA واکسینیا Cap 2'-O-Methyltransferase است، مشتق شد.این آنزیم یک گروه متیل را در موقعیت 2'-O اولین نوکلئوتید در مجاورت ساختار کلاهک در انتهای 5' انتهای RNA اضافه می کند. -0) منجر به ساختار کلاهک 1 می شود.

ساختار Cap1 می تواند کارایی ترجمه را افزایش دهد و بیان mRNA را در آزمایش های ترانسفکشن و تزریق ریز بهبود بخشد. این آنزیم به طور خاص به RNA با کلاهک m7GpppN به عنوان سوبسترا نیاز دارد.نمی تواند از RNA با pN، ppN، pppN یا GpppN در انتهای 5' استفاده کند.RNA درپوش دار ممکن است از طریق رونویسی آزمایشگاهی با استفاده از آنالوگ کلاهک یا از طریق دربندی آنزیمی با استفاده از آنزیم درپوش Vaccinia تهیه شود.

اجزاء

mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase (50U/μL)

10× بافر واکنش درپوش

ذخیره سازی

-25 ～- 15 ℃ برای ذخیره سازی (از تکرار چرخه های انجماد و ذوب خودداری کنید).

بافر ذخیره سازی

20 میلی‌مولار Tris-HCl (pH 8.0، 25 ℃)، 100 میلی‌مولار NaCl، 1 میلی‌مولار DTT، 0. 1 میلی‌مولار EDTA، 0. 1 درصد تریتون X-100، 50 درصد گلیسرول.

تعریف واحد

یک واحد به عنوان مقدار آنزیم مورد نیاز برای متیله کردن 10 pmoles از رونوشت RNA سرپوش دار 80 nt در 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد تعریف می شود.

سنجش های کنترل کیفیت

اگزونوکلئاز:50U mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase با 1μg λ-Hind III DNA هضم شده در دمای 37 ℃ به مدت 16 ساعت هیچ گونه تخریبی را که توسط الکتروفورز ژل آگارز تعیین شد، ایجاد نمی کند.

اندونوکلئاز: 50 واحد mRNA Cap 2' -O-Methyltransferase با 1 μg λDNA در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 16 ساعت هیچگونه تخریبی را که توسط الکتروفورز ژل آگارز تعیین شد، ایجاد نمی کند.

نیکاز: 50U mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase با 1μg pBR322 در دمای 37 ℃ به مدت 16 ساعت، همانطور که توسط الکتروفورز ژل آگارز تعیین شد، هیچ تخریبی ایجاد نمی کند.

RNase: 50U mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase با 1.6μg MS2 RNA به مدت 4 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد هیچگونه تخریبی را که توسط الکتروفورز ژل آگارز تعیین شد ایجاد نمی کند.

E. coli DNA50U از mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase برای حضورE. coli DNA ژنومی با استفاده از TaqMan qPCR با پرایمرهای مخصوصE. coli منبع 16S rRNA.اینE. coli آلودگی DNA ژنومی = 1 استE. coli ژنوم

باکتریایی اندوتوکسین: تست LAL، مطابق با نسخه 2020 فارماکوپه چینی IV، روش تست حد ژل، قانون کلی (1143).محتوای اندوتوکسین باکتریایی باید 10 EU/mg باشد.

سیستم و شرایط واکنش

1. مقدار مناسبی از RNA درپوش دار و H2O بدون RNase را در یک لوله میکروفیوژ 1.5 میلی لیتری تا حجم نهایی 16.0 میکرولیتر ترکیب کنید.

2. حرارت را در دمای 65 درجه به مدت 5 دقیقه و سپس حمام یخ به مدت 5 دقیقه گرم کنید.

3. اجزای زیر را به ترتیب مشخص شده اضافه کنید (برای متیلاسیون RNA درپوش

کمتر از 10

*10× بافر واکنش درپوش: 500 میلی‌مولار Tris-HCl (pH 8.0، 25 ℃)، 50 میلی‌مولار KCl، 10 میلی‌مولار MgCl2، 10 میلی‌مولار DTT.

4. در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 1 ساعت انکوباسیون (2 ساعت انکوباسیون برای قطعه هدف کمتر از 200 nt توصیه می شود).

برنامه های کاربردی

برای بهبود بیان mRNA در طی آزمایشات میکرواینجکشن و ترانسفکشن.

نکاتی در مورد استفاده

1. قبل از واکنش، RNA باید خالص شده و در آب بدون نوکلئاز حل شود، تمام محلول ها نباید حاوی EDTA و یون باشند.

2. توصیه می شود RNA نمونه را در دمای 65 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه قبل از واکنش گرم کنید تا ساختار ثانویه در انتهای 5' رونوشت حذف شود.می توان آن را تا 10 دقیقه برای ساختار ترمینال پیچیده 5' افزایش داد.