کیت الایزا RNA دو رشته ای (dsRNA).

این کیت یک سنجش ایمونوسوربنت متصل به آنزیم (ELISA) است که با سیستم بیوتین-استرپتاویدین جفت می شود، برای اندازه گیری کمی dsRNA با طول بیش از 60 جفت باز (bp)، صرف نظر از توالی.صفحه از قبل با آنتی بادی ضد dsRNA پوشانده شده است.dsRNA موجود در نمونه اضافه می شود و به آنتی بادی های پوشش داده شده روی چاهک ها متصل می شود.و سپس آنتی بادی ضد dsRNA بیوتینیله اضافه می شود و به dsRNA موجود در نمونه متصل می شود.پس از شستشو، HRP-Streptavidin اضافه می شود و به آنتی بادی ضد dsRNA بیوتینیله متصل می شود.پس از انکوباسیون، HRP-Streptavidin غیر متصل شسته می شود.سپس محلول بستر TMB اضافه شده و توسط HRP کاتالیز می شود تا یک محصول رنگ آبی تولید شود که پس از افزودن محلول توقف اسیدی به زرد تبدیل می شود.چگالی رنگ زرد متناسب با مقدار هدف dsRNA است که در صفحه گرفته شده است.جذب در 450 نانومتر اندازه گیری می شود.

کاربرد

این کیت برای اندازه گیری کمی dsRNA باقیمانده است.

اجزای کیت

ذخیره سازی و پایداری

1. برای کیت استفاده نشده: کل کیت را می توان در 2 ~ 8 ℃ در عمر مفید ذخیره کرد.برای پایداری انبار باید از نور شدید اجتناب شود.

2. برای کیت استفاده شده: هنگامی که میکروپلیت باز شد، لطفاً چاه های استفاده نشده را با سیلر بشقاب بپوشانید و به کیسه فویل حاوی بسته خشک کن برگردانید، کیسه فویل را با زیپ ببندید و پس از استفاده در اسرع وقت به دمای 2 ~ 8 درجه سانتیگراد برگردانید.سایر معرفها باید در اسرع وقت پس از استفاده به دمای 2 تا 8 درجه سانتیگراد برگردانده شوند.

مواد مورد نیاز اما عرضه نشده است

1. میکروپلیت خوان با فیلتر 450±10nm (بهتر است اگر بتواند در طول موج 450 و 650 نانومتر تشخیص دهد).

2. شیکر میکروپلیتی.

3. نوک های بدون RNase و لوله های سانتریفیوژ.

نمودار جریان عملیات

قبل از اینکه شروع کنی

1. تمام اجزای کیت و نمونه ها را قبل از استفاده به دمای اتاق (18-25 درجه سانتیگراد) برسانید.اگر کیت در یک بار مصرف نمی شود، لطفاً فقط نوارها و معرف ها را برای آزمایش فعلی خارج کنید و نوارها و معرف های باقیمانده را در شرایط لازم بگذارید.

2. بافر شستشو: 40 میلی لیتر از بافر شستشوی 20× غلیظ را با 760 میلی لیتر آب دیونیزه یا مقطر رقیق کنید تا 800 میلی لیتر بافر شستشو 1× تهیه شود.

3. استاندارد: قبل از استفاده، محلول موجود را به طور خلاصه بچرخانید یا سانتریفیوژ کنید.غلظت چهار استاندارد ارائه شده 5ng/μL است.برای استانداردهای UTP و pUTP dsRNA، لطفاً محلول موجود را به 1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg/μL با بافر STE رقیق کنید تا منحنی استاندارد رسم شود.برای استانداردهای N1-Me-pUTP dsRNA، لطفاً محلول موجود را به 2،1،0.5،0.25،0.125،0.0625،0.0312، 0pg/μL با بافر STE رقیق کنید تا منحنی استاندارد رسم شود.برای استاندارد dsRNA 5-OMe-UTP، لطفاً محلول موجود را به 4،2،1،0.5، 0.25،0.125،0.0625، 0pg/μL با بافر STE رقیق کنید تا منحنی استاندارد رسم شود.ما توصیه می کنیم استانداردها را می توان به صورت نمودارهای زیر رقیق کرد:

4. آنتی بادی تشخیص بیوتینیله و محلول کار HRP-استرپتاویدین: به طور خلاصه محلول موجود را قبل از استفاده بچرخانید یا سانتریفیوژ کنید.آنها را تا غلظت کار با بافر رقیق رقیق کنید.

5. بستر TMB: دوز مورد نیاز محلول را با نوک های استریل شده آسپیره کنید و باقیمانده محلول را دوباره داخل ویال نریزید.بستر TMB به نور حساس است، بستر TMB را برای مدت طولانی در معرض نور قرار ندهید.

با استفاده از پروتکل

1. تعداد نوارهای مورد نیاز برای سنجش را تعیین کنید.نوارها را برای استفاده در قاب ها قرار دهید.نوارهای صفحه باقیمانده که در این سنجش استفاده نشده اند باید در کیسه با ماده خشک کننده بسته بندی شوند.کیسه را برای نگهداری در یخچال محکم ببندید.

2. 100μL هر یک از رقت های استاندارد، بلانک و نمونه ها را به چاهک های مناسب اضافه کنید.با سیلر بشقاب بپوشانید.به مدت 1 ساعت در دمای اتاق با تکان دادن با دور 500 در دقیقه انکوبه کنید.نمونه ها باید با بافر STE تا غلظت مناسب برای سنجش دقیق رقیق شوند.

3. مرحله شستشو: محلول را آسپیره کنید و با 250 میکرولیتر بافر شستشو به هر چاهک بشویید و بگذارید 30 ثانیه بماند.با فشردن صفحه روی کاغذ جاذب، بافر شستشو را کاملاً دور بریزید.کلا 4 بار بشویید.

4. 100μL محلول فعال آنتی بادی تشخیص بیوتینیله را به هر چاه اضافه کنید.با سیلر بشقاب بپوشانید.به مدت 1 ساعت در دمای اتاق با تکان دادن با دور 500 در دقیقه انکوبه کنید.

5. مرحله شستشو را تکرار کنید.

6. 100μL محلول کار HRP-استرپتاویدین را به هر چاهک اضافه کنید.با سیلر بشقاب بپوشانید.به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق با تکان دادن با دور 500 در دقیقه انکوبه کنید.

7. مرحله شستشو را دوباره تکرار کنید.

8. 100μL محلول بستر TMB را به هر چاهک اضافه کنید.با سیلر بشقاب بپوشانید.به مدت 30 دقیقه در RT محافظت از نور انکوبه کنید.با افزودن محلول بستر، مایع آبی می شود.

9. 50μL محلول توقف را به هر چاه اضافه کنید.با افزودن محلول توقف، مایع زرد می شود.سپس میکروپلیت خوان را اجرا کنید و بلافاصله اندازه گیری را در 450 نانومتر انجام دهید.

محاسبه نتایج

1. میانگین قرائت های تکراری برای هر استاندارد، کنترل و نمونه را محاسبه کنید و چگالی نوری استاندارد صفر را کم کنید.یک منحنی استاندارد با جذب در محور عمودی (Y) و غلظت dsRNA در محور افقی (X) بسازید.

2. انجام محاسبات با نرم افزارهای برازش منحنی مبتنی بر کامپیوتر مانند curve expert 1.3 یا ELISA Calc در مدل برازش غیر خطی 5 یا 4 پارامتری توصیه می شود.

کارایی

1. حساسیت:

حد پایین تشخیص: ≤ 0.001pg/μL (برای UTP-، pUTP-، N1-Me-pUTP-dsRNA)، ≤ 0.01pg/μL (برای 5-OMe-UTP-dsRNA).

حد پایین کمی: 0.0156 pg/μL (برای UTP-، pUTP-dsRNA)، 0.0312 pg/μL (برای N1-Me-pUTP-dsRNA)، 0.0625 pg/μL (برای 5-OMe-UTP-dsRNA).

2. دقت: CV درون سنجشی ≤10%، CV درون سنجشی ≤10%

3. بازیابی: 80٪ ~ 120٪

4. خطی بودن: 0.0156-0.5pg/μL (برایUTP-,pUTP-dsRNA)0.0312-1pg/μL (برای N1-Me-pUTP dsRNA)، 0.0625-1pg/μL (برای 5-OMe-UTP-dsRNA).

ملاحظات

1. دمای واکنش TMB ​​و زمان بسیار مهم است، لطفا آنها را با توجه به دستورالعمل به شدت کنترل کنید.

2. به منظور دستیابی به تکرارپذیری و حساسیت آزمون، شستشوی مناسب صفحات برای حذف معرف های اضافی واکنش نداده ضروری است.

3. تمام معرف ها باید قبل از استفاده کاملاً مخلوط شوند و از ایجاد برآمدگی در حین افزودن نمونه یا معرف جلوگیری شود.

4. اگر کریستال ها در بافر غلیظ شستشو (20 برابر) تشکیل شده است، آن را تا 37 درجه سانتیگراد گرم کنید و به آرامی مخلوط کنید تا کریستال ها کاملا حل شوند.

5. از آزمایش نمونه های حاوی سدیم آزید (NaN3) خودداری کنید، زیرا می تواند فعالیت HRP را از بین ببرد و منجر به تخمین کمتر از مقدار dsRNA شود.

6. از آلودگی RNase در طول آزمایش اجتناب کنید.

7. استاندارد/نمونه، آنتی بادی تشخیص و SA-HRP نیز می تواند در RT بدون تکان دادن انجام شود، اما این ممکن است باعث کاهش حساسیت تشخیص تا یک برابر شود.برای این مورد، توصیه می کنیم استانداردهای UTP و pUTP dsRNA از 2pg/μL، استانداردهای N1-Me-pUTP dsRNA از 4pg/μL و استاندارد 5-OMe-UTP dsRNA باید از 8pg/μL رقیق شوند.علاوه بر این، محلول کار HRP-streptavidin را به مدت 60 دقیقه در دمای اتاق انکوبه کنید.از فلاسک شیکر استفاده نکنید، زیرا فلاسک شیکر ممکن است منجر به نتیجه نادرست شود.

نتیجه معمولی

1. داده های منحنی استاندارد

2. محاسبه منحنی استاندارد

3. محدوده تشخیص لاینر: 0.0312- 1pg/μL