کیت CHO HCP ELISA
در این روش از روش ELISA ایمونوسوربنت یک مرحله ای استفاده می شود.نمونه های حاوی CHOK1 HCP به طور همزمان با آنتی بادی ضد CHOK1 بز نشاندار شده با HRP و آنتی بادی ضد CHOK1 پوشش داده شده روی صفحه ELISA واکنش می دهند و در نهایت یک مجموعه ساندویچی از آنتی بادی فاز جامد نشاندار شده با آنتی بادی HCP تشکیل می دهند.آنتی ژن-آنتی بادی غیر متصل را می توان با شستن صفحه الایزا حذف کرد.بستر TMB برای واکنش کافی به چاه اضافه می شود.توسعه رنگ پس از افزودن محلول توقف متوقف می شود و مقدار OD یا مقدار جذب محلول واکنش در 450/650 نانومتر با یک میکروپلیت خوان خوانده می شود.مقدار OD یا مقدار جذب متناسب با محتوای HCP در محلول است.از این رو می توان غلظت HCP در محلول را طبق منحنی استاندارد محاسبه کرد.
کاربرد
این کیت برای تشخیص کمی محتوای پروتئین سلول میزبان CHOK1 در نمونه ها استفاده می شود.
Cاجزاء
| S/N | جزء | تمرکز | شرایط نگهداری |
| 1 | استاندارد CHOK1 HCP | 0.5 میلی گرم در میلی لیتر | ≤–20℃ |
| 2 | Anti-CHO HCP-HRP | 0.5 میلی گرم در میلی لیتر | ≤–20℃، از نور محافظت کنید |
| 3 | TMB | NA | 2-8 ℃، از نور محافظت کنید |
| 4 | 20 × PBST 0.05٪ | NA | 2-8 درجه سانتیگراد |
| 5 | راه حل را متوقف کنید | NA | RT |
| 6 | سیلرهای میکروپلیتی | NA | RT |
| 7 | BSA | NA | 2-8 درجه سانتیگراد |
| 8 | صفحات پیش پوشش با جذب بالا | NA | 2-8 درجه سانتیگراد |
تجهیزات مورد نیاز
| مواد مصرفی / تجهیزات | ساخت | کاتالوگ |
| میکروپلیت خوان | دستگاه های مولکولی | Spectra Max M5، M5e یا معادل آن |
| ترمومیکسر | اپندورف | Eppendorf/5355 یا معادل آن |
| میکسر گرداب | IKA | MS3 Digital یا معادل آن |
ذخیره سازی و پایداری
1.حمل و نقل در -25 ~ 15 درجه سانتی گراد.
2.شرایط نگهداری همانطور که در جدول 1 نشان داده شده است.اجزای 1-2 در دمای ≤-20 درجه سانتیگراد، 5-6 ذخیره می شوند RT,3،4، 7، 8 در 2-8 ℃ ذخیره می شوند.مدت اعتبار 12 ماه است.
پارامترهای محصول
1.حساسیت: 1ng/ml
2.محدوده تشخیص: 3-100ng/ml
3.دقت: CV ≤ 10% درون آزمون، CV≤ 15% درون آزمون
4.پوشش HCP: > 80٪
5.ویژگی: این کیت جهانی است زیرا به طور خاص با CHOK1 HCP مستقل از فرآیند تصفیه واکنش نشان می دهد.
آماده سازی معرف
1.PBST 0.05٪
15 میلی لیتر 20×PBST 0.05 درصد، رقیق شده در ddH مصرف کنید2O، و تا 300 میلی لیتر ساخته شده است.
2.1.0٪ BSA
1 گرم BSA را از بطری بردارید و در 100 میلی لیتر PBST 0.05% رقیق کنید، خوب مخلوط کنید تا کاملا حل شود و در دمای 2-8 درجه سانتیگراد نگهداری کنید.بافر رقت آماده شده به مدت 7 روز معتبر است.توصیه می شود در صورت نیاز تهیه شود.
3.محلول تشخیص 2μg/mL
48 میکرولیتر از 0.5 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر Anti-CHO HCP-HRP را مصرف کنید و در 11952 میکرولیتر BSA 1 درصد رقیق کنید تا غلظت نهایی 2 میکروگرم بر میلی‌لیتر محلول تشخیص به دست آید.
4.QC و تهیه استانداردهای CHOK1 HCP
| لوله خیر | اصل | تمرکز | جلد | 1٪ BSA | حجم کل | نهایی |
| A | استاندارد | 0.5 میلی گرم در میلی لیتر | 10 | 490 | 500 | 10000 |
| B | A | 10000 | 50 | 450 | 500 | 1000 |
| S1 | B | 1000 | 50 | 450 | 500 | 100 |
| S2 | S1 | 100 | 300 | 100 | 400 | 75 |
| S3 | S2 | 75 | 200 | 175 | 375 | 40 |
| S4 | S3 | 40 | 150 | 350 | 500 | 12 |
| S5 | S4 | 12 | 200 | 200 | 400 | 6 |
| S6 | S5 | 6 | 200 | 200 | 400 | 3 |
| NC | NA | NA | NA | 200 | 200 | 0 |
| QC | S1 | 100 | 50 | 200 | 250 | 20 |
جدول: تهیه QC و استانداردها
روش سنجش
1.معرف ها را همانطور که در "آماده سازی معرف" در بالا نشان داده شده است، آماده کنید.
2.50 میکرولیتر از استانداردها، نمونه‌ها و QCها (به جدول 3 مراجعه کنید) در هر چاه برداشته، سپس 100 میکرولیتر محلول تشخیص (2 میکروگرم بر میلی‌لیتر) اضافه کنید.صفحه را با سیلر بپوشانید و صفحه الایزا را روی ترمومیکسر قرار دهید.انکوبه در 500 دور در دقیقه، 25±3 درجه سانتیگراد به مدت 2 ساعت.
3.میکروپلیت را در سینک برگردانید و محلول پوشش را دور بریزید.300 میکرولیتر PBST 0.05% را در هر چاهک پیپت کنید تا صفحه الایزا را بشویید و محلول را دور بریزید و شستشو را 3 بار تکرار کنید.بشقاب را روی یک حوله کاغذی تمیز برگردانید و خشک کنید.
4.100 میکرولیتر از بستر TMB (به جدول 1 مراجعه کنید) به هر چاهک اضافه کنید، صفحه ELISA را ببندید و در تاریکی در دمای 3±25 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه انکوبه کنید.
5.100μL محلول توقف را در هر چاه پیپت کنید.
6.اندازه گیری جذب در طول موج 450/650 نانومتر با میکروپلیت ریدر.
7.تجزیه و تحلیل داده ها توسط SoftMax یا نرم افزار مشابه.منحنی استاندارد را با استفاده از مدل رگرسیون لجستیک چهار پارامتری ترسیم کنید.
مثال منحنی استاندارد
توجه: اگر غلظت HCP در نمونه از حد بالایی منحنی استاندارد فراتر رود، باید قبل از آزمایش به درستی با بافر رقت رقیق شود.
یادداشت
محلول توقف 2M اسید سولفوریک است، لطفا با احتیاط رفتار کنید تا پاشیده نشود!
